纖維素酶法提取無患子皂苷的工藝優化

彭怡心，符春花，王亞，吳澤君

（株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 412000）

無患子皂苷為天然的非離子型表面活性劑，具有很強的降低表面張力的作用［1］，泡沫豐富、手感細膩、去污力強、易降解、對皮膚刺激性小，是洗發香波、化妝品以及各種生物洗滌劑的優良原料［2］。同時無患子皂苷還具有抗細菌、抗真菌、殺蟲、抗炎、抗腫瘤、保肝等功效［3］，對人體皮膚有抗菌、殺菌和消炎作用，還有去屑止癢功效，經科學純化處理的無患子洗潔產品還具有泡沫豐富、柔嫩肌膚、增白祛斑、祛痘、防治皮膚病等特點［4，5］。因此，無患子皂苷在醫藥及日化領域的價值倍受重視，具有廣闊的市場前景。

目前關于無患子皂苷提取方式主要包括溶劑浸提、超聲提取、酶提取、微波提取等［6-17］，其中大部分采用有機溶劑提取法，雖然雜質含量較水提法低，但成本較高，易引起環境和安全問題。酶具有高效性和特異性，可改變植物細胞壁的通透性，有利于活性成分的溶出［18，19］，魏鳳玉等［20］發現纖維素酶有助于無患子皂苷的提取，提取率比未加酶處理時提高了19.63%。鄭林祿等［21］采用復合酶提取無患子皂苷，得出當復合酶質量濃度0.6 mg/mL，酶解溫度50℃，pH 4.5，酶解時間2.5 h時，提取率為64.40%。因此從環保和經濟的角度考慮，本研究以水為溶劑，采用纖維素酶解法首次分粒度提取無患子皂苷，并以高效液相色譜法測定及計算皂苷的提取率，優化了粒度較大無患子粉末的提取工藝，有效提高了皂苷的提取率并節約了資源和成本，同時探究了不同纖維素酶對不同粒度無患子皂苷提取率的影響，為無患子皂苷的工業化生產和原料粒度分級提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

纖維素酶（酶活力≥15 000 U/g）、無水乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）均為國藥集團化學試劑有限公司生產；纖維素酶RS（酶活力16 000 U/g），北京拜爾迪生物技術有限公司；纖維素酶（酶活力50 U/mg），上海源葉生物科技有限公司；無患子果皮粉，湖南省仙泉自然生物科技有限責任公司。

試驗儀器：藥典篩，浙江上虞市五四儀器廠；XSE105DU型電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿易有限公司；SHY-2A型水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；醫用離心機，湖南平凡科技有限公司；Utimate 3000 HPLC，賽默飛世爾科技中國有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理取無患子果皮粉碎后分別過1-2號篩（過1號篩、不能通過2號篩），2-3號篩（過2號篩、不能通過3號篩），3-5號篩（過3號篩、不能通過5號篩），大于5號篩（全部通過5號篩）得到4組不同粒度的無患子粉末。

1.2.2 無患子皂苷的提取稱取不同粒度的無患子粉末，用去離子水作為溶劑以1∶10固液比置于50 mL離心管中，加酶后于一定溫度的水浴恒溫振蕩器中酶解一定時間，每隔0.5 h振搖20 s，轉速100 r/min。將離心管置于80℃恒溫水浴鍋滅酶30 min，8 000 r/min離心10 min后吸取上清液即為無患子皂苷水提液。

1.2.3 標準曲線的制作準確稱取自制無患子皂苷對照品（分離純化的部分物質）0.04 g用甲醇溶解并定容至10 mL，稀釋得到0.05、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 mg/mL濃度的皂苷標準系列溶液，按照液相色譜條件：色譜柱Xtimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動相：A為水，B為乙腈，洗脫梯度見表1；流速1 mL/min；檢測波長205 nm進行測定。以峰面積為縱坐標，無患子皂苷對照品質量濃度（mg/mL）為橫坐標制作標準曲線，建立皂苷含量的回歸方程y=50.276x-0.671 1，R2=0.999 4。

表1 洗脫梯度

1.2.4 無患子皂苷提取率的計算取“1.2.2”中的無患子皂苷水提液用無水乙醇稀釋5倍，離心后吸取上清液用“1.2.3”中液相色譜方法測定峰面積，根據標準曲線得出測定液中無患子皂苷的濃度，皂苷提取率計算公式如下。

式中，w表示無患子皂苷提取率（%）；c表示測定液中無患子皂苷的濃度（mg/mL）；v表示提取液的體積（mL）；m表示無患子粉末質量（g）；f表示稀釋倍數。

1.2.5 統計分析每組試驗重復3次，采用SPSS Statistics 22軟件進行數據分析，Origin 2019軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同纖維素酶對不同粒度無患子皂苷提取率的影響

將北京拜爾迪生物技術有限公司、上海源葉生物科技有限公司、國藥集團化學試劑有限公司生產的纖維素酶按照同一酶活定義換算酶活單位后，按照6、15 U/mL分別加入4組不同粒度的無患子粉末中，50℃酶解2 h，同時做空白試驗，考察不同纖維素酶對不同粒度無患子皂苷提取率的影響。由圖1可知，拜爾迪纖維素酶對2-3號篩、3-5號篩、大于5號篩無患子粉末的皂苷提取率有促進作用，對1-2號篩的粉末無明顯影響。酶活濃度為15 U/mL時2-3號篩粉末的皂苷提取率從2.83%提高至3.21%，提高了13.4%，3-5號篩無患子皂苷提取率從3.42%提高至4.22%，對大于5號篩的粉末皂苷提取率也有明顯提高。

圖1 拜爾迪纖維素酶對不同粒度無患子皂苷提取率的影響

由圖2可知，上海源葉纖維素酶提高了1-2號篩、2-3號篩、3-5號篩無患子粉末的皂苷提取率，而對更細的粉末促進作用不明顯。6 U/mL和15 U/mL酶活濃度使1-2號篩粉末的皂苷提取率分別提高了7.09%和8.96%，使2-3號篩無患子皂苷提取率從2.83%分別提高至3.04%和3.06%，提高了7.42%和8.13%，同時15 U/mL酶活濃度還將3-5號篩的皂苷提取率提高了19.3%。

圖2 上海源葉纖維素酶對不同粒度無患子皂苷提取率的影響

由圖3可知，國藥纖維素酶對1-2號篩、2-3號篩、3-5號篩無患子粉末的皂苷提取率有明顯促進作用，對更細的大于5號篩的粉末幾乎無影響。15 U/mL酶活濃度將1-2號篩無患子皂苷提取率提高了13.1%，將2-3號篩粉末皂苷提取率提高了13.4%，同時6、15 U/mL的纖維素酶活濃度還使3-5號篩粉末提取率分別提高了16.1%和20.8%。

圖3 國藥纖維素酶對不同粒度無患子皂苷提取率的影響

綜上可知，由于無患子皂苷工業化提取時考慮成本、能耗等因素對原料的粉碎程度不會特別高，大多數為最粗粉或粗粉級別，即1-2號篩、2-3號篩粉末，少數為3-5號篩級別，國藥纖維素酶對前2種粒度無患子粉末的皂苷提取率提高得最明顯，同時對更細的3-5號篩粉末促進作用較明顯，因此選國藥纖維素酶和1-2號篩、2-3號篩粉末做下一步試驗。同時可以看出粒度越小的無患子粉末皂苷提取率越大，當粉末粒度均大于5號篩時纖維素酶對無患子皂苷的提取率幾乎無影響或促進作用較小，說明無患子果皮粉碎的越細，越有利于皂苷的提取，當植物細胞粉碎的很細時極大促進了皂苷的溶出從而使酶的破壁作用不明顯。因此，對于無患子皂苷工業化提取時，原料粉末加酶提取可選擇國藥的纖維素酶，而對原料粒度大于5號篩時，考慮成本因素可不加纖維素酶提取，這為無患子皂苷工業化提取的粒度分級提供了參考。

2.2 纖維素酶添加量對無患子皂苷提取率的影響

在纖維素酶添加量分別為0、3、6、12、18、24 U/mL時，50℃條件下提取2 h，考察加酶量對1-2號篩、2-3號篩無患子粉末皂苷提取率的影響。由圖4可知，隨著纖維素酶活濃度的增加，1-2號篩粉末的皂苷提取率逐步提高，至18 U/mL時提取率顯著提高且達到最大，從2.79%提高至3.15%，之后隨著酶添加量的增加，皂苷提取率無顯著變化，因此對1-2號篩無患子粉末皂苷提取的最佳酶活濃度為18 U/mL。對2-3號篩無患子粉末隨著酶活濃度的提高，皂苷提取率整體呈上升趨勢，至12 U/mL時提取率顯著提高，從2.82%提高至3.24%，再增加酶的濃度雖然有所提高但考慮成本因素，酶活濃度12 U/mL最合適。

圖4 酶添加量對1-2號篩、2-3號篩無患子皂苷提取率的影響

綜上分析，對最粗粉（1-2號篩）和粗粉（2-3號篩）而言，在無患子皂苷提取時加入一定量的纖維素酶，改變了其果皮細胞壁的通透性，促進了無患子果皮細胞中皂苷的溶出，使得提取率增加，且要達到一定的酶活濃度皂苷提取率才有顯著提高，對于越粗的原料粉末所需酶活濃度越高。

2.3 酶解時間對無患子皂苷提取率的影響

1-2號篩、2-3號篩無患子粉末加酶量分別為18、12 U/mL，50℃條件下酶解0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 h，考察酶解時間對無患子皂苷提取率的影響。由圖5可知，1-2號篩無患子粉末（最粗粉）隨著酶解時間的延長，皂苷提取率先增加后略有降低，當酶解時間為2.5 h時皂苷提取率為3.16%，達到最大值，之后便不再增加，因此對于1-2號篩無患子粉末在加酶量為18 U/mL時酶解2.5 h即可。2-3號篩無患子粉末（粗粉）隨著酶解時間的延長，皂苷提取率先增加后下降，當酶解時間為1.5 h時皂苷提取率最大，達3.32%，之后隨著酶解時間的延長皂苷提取率不再增加。因此對于2-3號篩無患子粉末在加酶量為12 U/mL時最佳酶解時間為1.5 h。

圖5 酶解時間對1-2號篩、2-3號篩無患子皂苷提取率的影響

綜上分析，2種粒度無患子粉末在最佳纖維素酶添加量的條件下，皂苷提取率均隨著酶解時間的延長先增加，當達到一定時間時皂苷提取率均不再增加，可能是因為2種粒度的無患子粉末在各自酶添加量的條件下分別提取2.5、1.5 h后酶促反應已達到平衡，之后略有下降可能是因為無患子皂苷大部分為三萜皂苷，而三萜皂苷多具有羧基，纖維素分解產物葡萄糖可能會與其發生酯化反應使得皂苷提取率有所下降，并且無患子皂苷提取率隨酶解時間的變化并不顯著。

2.4 酶解溫度對無患子皂苷提取率的影響

1-2號篩、2-3號篩無患子粉末在酶添加量分別為18、12 U/mL，提 取 溫 度 分 別 為30、40、50、60、70℃，酶解1.5 h時，考察酶解溫度對無患子皂苷提取率的影響。由圖6可知，1-2號篩無患子粉末隨著酶解溫度的升高，皂苷提取率上升，50℃時提取率最大，達3.00%，繼續升高溫度則皂苷提取率顯著下降，因此對1-2號篩無患子粉末最適提取溫度為50℃。2-3號篩無患子粉末隨著酶解溫度的增高，皂苷提取率逐漸增大，至50℃時達到最大，提取率為3.28%，之后隨溫度升高皂苷提取率反而明顯下降。

圖6 酶解溫度對1-2號篩、2-3號篩無患子皂苷提取率的影響

綜上分析，酶解溫度對2種粒度的無患子皂苷提取率均有顯著影響，由于高溫會破壞纖維素酶的蛋白結構使酶變性失活從而導致皂苷提取率顯著下降，同時低溫也會抑制纖維素酶的活性使得溫度低于50℃時皂苷提取率偏低。

3 小結

本試驗首次對無患子果皮粉末進行了粒度分級并按粒度優化了纖維素酶法提取無患子皂苷的工藝條件，探究多種纖維素酶對不同粒度的無患子粉末的影響，得出當粉末粒度大于5號篩時纖維素酶對無患子皂苷提取率幾乎無影響或促進作用較小，即當植物細胞粉碎得很細時極大促進了皂苷的溶出從而使酶的破壁作用不明顯，纖維素酶法提取無患子皂苷的較優工藝條件為1-2號篩粉末（最粗粉）酶添加量18 U/mL，酶解時間2.5 h，酶解溫度50℃；2-3號篩粉末（粗粉）酶添加量12 U/mL，酶解時間1.5 h，酶解溫度50℃，對于粒度大于5號篩的考慮成本因素可不加纖維素酶提取，該方法經濟環保，可有效提高無患子中皂苷的提取率，為纖維素酶法工業化提取無患子皂苷打下基礎。