發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道結構、腸組織基因表達及腸道菌群的影響

何維敏，況世昌，李筱雯，王純，崔衛濤，王喜亮，肖運才，李自力，周祖濤

（1.華中農業大學動物醫學院/湖北省預防獸醫學重點實驗室，武漢 430070；2.湖北華大瑞爾科技有限公司/生物發酵制劑湖北省工程研究中心，武漢 430070）

腸道具有皺襞、絨毛和微絨毛等結構，是動物機體重要的功能性器官，除具有消化食物、吸收營養的功能，還具有防止外界病原、毒素等有害物質侵入的腸屏障功能［1］。腸道主要通過3個屏障來保護機體免受病原的感染，分別是黏膜屏障、微生物屏障和免疫屏障［2］。腸黏膜屏障又由腸黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接和菌膜構成［3］。腸道菌群對腸道屏障有較大影響，腸道菌群加速腸上皮細胞更新，改善腸道形態結構；與腸上皮細胞相互作用促進上皮細胞合成和分泌抗菌肽［4］；參與調節分泌腸道免疫活性因子抵御致病菌［5］。仔豬自然斷奶時間為17周齡，集約化養殖將仔豬斷奶時間提前至3～4周齡。當斷奶發生時，仔豬飼喂環境發生巨大變化，出現食欲下降、生長減緩、免疫力下降、腹瀉甚至死亡，上述變化稱為早期斷奶綜合征即斷奶應激。斷奶應激對仔豬的影響主要集中于腸道，主要表現為對腸道結構、腸道微生物和腸道免疫的影響［4］。研究表明，在仔豬飲水中加入復方中藥制劑能夠改善仔豬的生長性能，提高仔豬免疫力，緩解斷奶應激癥狀［6］。微生態制劑具有黏附作用和競爭性抑制作用，與病原菌搶占腸道黏膜的結合位點，抑制其繁殖，發揮屏障功能［7］。

本試驗將發酵中藥微生態制劑（組方：白術、白芍、黨參、茯苓）和微生態制劑聯合添加在斷奶仔豬日糧中，測定仔豬腸道結構、腸組織基因表達和腸道菌群變化，為微生態制劑在緩解仔豬斷奶應激中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

發酵中藥微生態制劑：經薄層色譜鑒定合格的發酵中藥合劑，主要成分：白術、白芍、黨參、茯苓，由湖北華大瑞爾科技有限公司提供。

微生態制劑：枯草芽孢桿菌TL，有效活菌數2.0×1011CFU/g，由湖北華大瑞爾科技有限公司提供。

1.2 試驗動物與試驗設計

選取23日齡斷奶、平均體重為（7.744±0.446）kg的杜長大三元雜交健康仔豬120頭，隨機分為4個組：對照組（基礎日糧）、抗生素組（基礎日糧+0.075 g/kg金霉素+0.015 g/kg恩拉霉素+0.1 g/kg喹乙醇）、試驗Ⅰ組（基礎日糧+0.3%發酵中藥微生態制劑+0.15 g/kg枯草芽孢桿菌TL）、試驗Ⅱ組（基礎日糧+0.3%發酵中藥微生態制劑+0.3 g/kg枯草芽孢桿菌TL），每組3個重復，每個重復10頭仔豬。飼喂時間為仔豬保育階段，具體從23日齡開始到52日齡結束，共30 d。

1.3 試驗日糧

仔豬前期乳豬料和后期仔豬料由湖北加益加生物科技有限公司提供，其乳豬料為粉料，仔豬料為顆粒料。每天飼喂前將抗生素、發酵中藥微生態制劑和微生物制劑分別與基礎日糧充分混合后投入使用，保證現配現用。

1.4 飼養管理

試驗于3—4月進行。在仔豬斷奶后第1周飼喂乳豬料，斷奶后第8～11天將乳豬料和仔豬料分別按照4∶1、3∶2、2∶3、1∶4的比例進行混合飼喂，逐步將乳豬料過渡到仔豬料。每天飼喂仔豬4次，時間分別是8：00、12：00、16：00和20：00，計量不限料（以料槽無剩余料為原則）并按欄記錄飼料投喂量；采用鴨嘴式自動飲水器，自由飲水。期間免疫接種程序按規?；i場養殖程序進行。

1.5 指標測定

1.5.1 腸道形態結構的測定試驗結束后，各組分別選取3只仔豬，屠宰，從十二指腸、空腸和回腸中段小心切取約2 cm長的組織樣品，石蠟包埋切片后進行蘇木素-伊紅（HE）染色封片，使用日本Nikon 80i生物光學顯微鏡并結合NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統進行觀察、取圖和拍照，測定10根完整絨毛髙度（VH）和隱窩深度（CD），并計算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/CD）。

1.5.2 腸組織基因表達水平的測定分別提取十二指腸和空腸組織RNA，以組織中β-actin為內參基因，RT-PCR檢測十二指腸和空腸中黏蛋白MUC2、緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA表達水平，PCR引物如表1所示。

表1 基因PCR引物

1.5.3 腸道菌群的測定各組分別選取3只仔豬，分別取盲腸內容物，使用Aidlab糞便基因組DNA快速提取試劑盒提取盲腸內容物DNA。qRT-PCR法檢測盲腸內容物中大腸桿菌和乳酸桿菌含量，方法參考Chiang等［11］和Walter等［12］。每個樣品3個重復，根據標準曲線計算定量結果。

1.6 數據分析

試驗數據用Excel 2007軟件初步處理，再用SPSS 19.0軟件進行統計分析。試驗數據經方差同質性和正態性檢驗，滿足條件后進行方差分析。利用ONE-WAY ANOVA、LSD進行差異顯著性檢驗，在差異顯著基礎上用Ducan法做多重比較，試驗結果以“平均值±標準差（x±S）”形式表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道形態的影響

發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道形態的影響結果見表2。由表2可知，與對照組、抗生素組和試驗Ⅱ組相比，試驗Ⅰ組的十二指腸VH/CD值分別提高32.27%、4.26%和8.60%，差異極顯著（P＜0.01）。

表2 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道形態的影響

空腸腸道形態結果表明，與對照組相比，抗生素組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組腸絨毛高度分別提高了20.23%（P＜0.01）、24.23%（P＜0.01）和12.43%（P＜0.01），其隱窩深度則分別降低了6.23%（P＜0.01）、9.49%（P＜0.01）和11.69%（P＜0.01），VH/CD值分別提高了28.23%（P＜0.01）、37.23%（P＜0.01）和27.31%（P＜0.01）。試驗Ⅰ組VH/CD值比抗生素組提高了7.02%（P＜0.01）。

回腸腸道形態結果表明，與對照組和抗生素相比，試驗Ⅰ組VH/CD值分別提高了56.44%（P＜0.01）和43.83%（P＜0.01），試驗Ⅱ組VH/CD值則分別提高了36.89%（P＜0.01）和25.86%（P＜0.01）。試驗Ⅰ組與試驗Ⅱ組比，VH/CD值提高14.28%（P＜0.01）。

2.2 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道基因表達量的影響

發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道基因表達量的影響結果見圖1、圖2。由圖1可知，與對照組相比，抗生素組和試驗Ⅰ組MUC2基因mRNA表達上調，試驗Ⅱ組下調（P＞0.05）?？股亟M和試驗Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），與試驗Ⅱ組差異顯著（P＜0.05），試驗Ⅰ組效果優于試驗Ⅱ組。

圖1 腸道黏蛋白MUC2基因表達量

由圖2可知，與對照組相比，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組十二指腸胞質蛋白ZO-1基因mRNA表達水平上調（P＞0.05），但跨膜蛋白Occludin基因mRNA表達水平都下調（P＞0.05）。與對照組相比，試驗Ⅱ組空腸胞質蛋白ZO-1基因表達上調（P＞0.05），試驗Ⅰ組空腸跨膜蛋白Occludin基因表達上調（P＞0.05），試驗Ⅱ組Occludin基因表達下調（P＞0.05）。

圖2 小腸緊密連接蛋白ZO-1基因和Occludin基因mRNA表達量

2.3 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道菌群的影響

大腸桿菌、乳酸桿菌qRT-PCR標準曲線見圖3。大腸桿菌K88標準曲線為y=-5.101 0x+55.960，R2為0.998 0；乳酸桿菌標準曲線為y=-3.841 1x+46.305，R2為0.997 8，符合試驗要求，說明標準曲線構建成功。

圖3 大腸桿菌K88和乳酸桿菌標準曲線

發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道菌群的影響結果見表3。由表3可知，抗生素組和試驗Ⅰ組中大腸桿菌數量較低，但與對照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。試驗Ⅰ組乳酸桿菌數量均提高，較對照組和抗生素組提高21.22%（P＜0.05）和33.70%（P＜0.01），試驗Ⅱ組乳酸桿菌數量高于抗生素組（P＜0.05），但與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道菌群的影響

3 討論

3.1 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道結構的影響

小腸是機體消化和吸收的主要部位，腸壁形態結構的完整性是影響腸道健康和機體消化吸收的關鍵。腸道功能與絨毛高度和隱窩深度密切相關。小腸絨毛是腸上皮和固有層向腸腔內突而成，與小腸柱狀細胞表面的微絨毛，擴大了黏膜表面積，增加了小腸與養分之間的接觸面積，能有效促進養分的消化和吸收，故絨毛長度增長，表示腸道營養吸收功能也會提高。腸隱窩又稱小腸腺，是相鄰絨毛根部的上皮向固有層內凹所形成的管狀腺體，在隱窩中下部的干細胞能不斷分裂增殖，產生的子細胞向上遷移至絨毛頂端，并分化成熟來補充絨毛上皮頂端凋亡脫落的吸收細胞和杯狀細胞［13］。隱窩變淺表示細胞凋亡速度減緩，腸上皮細胞成熟率上升，絨毛形態正常。絨毛和隱窩比值反映小腸營養物質消化吸收功能的綜合性指標，其比值越大，表明小腸的消化吸收功能越強［14］。

劉惠［15］將中草藥復合粗多糖應用于斷奶仔豬后可較大程度提高其小腸絨毛高度和VH/CD值。殷超［16］用由黃芪、黃芩、黃柏、黨參等中藥提取物所組成的中草藥復方制劑作用于斷奶仔豬后能顯著增加小腸絨毛高度，降低了隱窩深度。仔豬早期斷奶應激會使腸絨毛高度下降、隱窩深度加深。本試驗在斷奶仔豬日糧中添加中藥微生態制劑和抗生素可以提高十二指腸、空腸及回腸的絨毛高度和VH/CD值（P＜0.01），降低了各小腸隱窩深度，且中藥微生態制劑組效果優于抗生素組，表明中藥微生態制劑在保護斷奶仔豬小腸的正常結構、促進腸道形態發育、增強機體對營養物質的消化吸收等方面有重要作用。

3.2 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸組織基因表達的影響

MUC2是跨膜糖蛋白分子，是黏液細胞分泌的主要黏蛋白，能形成彈性的膠體狀覆蓋物，保護黏膜免受物理、化學、病原微生物等各種有害因素的損傷，并參與細胞間的黏附及信號轉導，對細胞生長、發育、增殖和分化，維持細胞完整性等過程有顯著影響，是消化道內先天性免疫屏障的重要組成部分。緊密連接（TJ）作為細胞間最重要的連接方式，位于腸上皮細胞膜外側的頂部，主要由ZO-1、Occludin、Claudins 3種蛋白構成，與腸上皮細胞共同形成動態的選擇性通透屏障（機械屏障），在阻止病原體等有害物質進入機體的同時，允許營養物質進入體內，對維持腸道上皮屏障功能的完整性及腸上皮細胞的極性和通透性具有重要作用［17，18］。王元心［19］研究發現益生菌有促進黏蛋白MUC2的分泌，升高mRNA表達水平的作用，有利于增強雛雞黏膜免疫屏障的防御功能。本研究中，與對照組相比，抗生素組和中藥微生態制劑Ⅰ組空腸中MUC2基因mRNA表達水平上調，中藥微生態制劑Ⅱ組與對照組差異不顯著（P＞0.05），說明中藥微生態制劑和抗生素可以增加仔豬腸道MUC2的表達量，增強腸道的化學屏障功能。研究表明，緊密連接蛋白質的高表達可維持腸黏膜機械屏障的完整性，對維持斷奶仔豬腸黏膜通透性和阻止有害物質入侵起重要作用［20，21］。

本研究發現試驗Ⅱ組斷奶仔豬十二指腸和空腸ZO-1基因表達上調（P＞0.05），Occludin基因表達略下調（P＞0.05）；中藥微生態制劑Ⅰ組斷奶仔豬十二指腸中ZO-1基因表達上調（P＞0.05），Occludin基因表達略下調（P＞0.05），空腸中ZO-1基因表達略下調（P＞0.05），Occludin基因表達上調（P＞0.05），其原因還需進一步探究。

3.3 發酵中藥微生態制劑對斷奶仔豬腸道菌群的影響

動物在健康情況下腸道內微生物菌群維持平衡狀態，斷奶后仔豬在飲食、飼養等方面發生劇烈變化，易誘發由斷奶應激導致的腸道微生物菌落紊亂、失衡，使得大腸桿菌等有害菌數量增加，乳酸桿菌等有益菌數量減少，導致仔豬腸道屏障能力迅速降低，極易誘發各種疾?。?2］。韓劍眾等［23］研究發現由黃芪、當歸、茯苓、柴胡和大黃等中藥的有效成分組成的合劑能明顯提高斷奶仔豬盲腸內乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量，降低大腸桿菌的含量。宋良敏［24］用枯草芽孢桿菌、糞腸球菌等制成的復合微生態飼料添加劑，添加到斷奶仔豬日糧中，發現腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的數量增多，大腸桿菌的數量減少。本研究發現在斷奶仔豬日糧中添加抗生素在降低大腸桿菌數量的同時，顯著抑制了乳酸桿菌的生長，而聯用發酵中藥微生態制劑和微生態制劑，不僅能抑制大腸桿菌的增殖，還促進了乳酸桿菌的生長，且試驗Ⅰ組效果要優于試驗Ⅱ組。

4 結論

在斷奶仔豬日糧中添加0.3%發酵中藥微生態制劑和0.15 g/kg枯草芽孢桿菌TL，可提高十二指腸、空腸和回腸VH/CD值，促進盲腸內容物乳酸桿菌繁殖，降低盲腸內容物大腸桿菌數量，但對腸道基因表達作用不明顯。