花花柴蠟質合成相關基因KcFAD2的克隆及轉基因煙草耐高溫性鑒定

曲航飛，許疆維，王彥芹

（塔里木大學生命科學與技術學院，新疆 阿拉爾 843300）

植物表皮蠟質是植物與外界環境直接相接觸的一層疏水保護層，在不同的物種之間，植物表皮蠟質的結構和組成均有很大差異，但都具有類似的蠟質合成途徑，前人對該途徑的研究已經取得了顯著的成果。植物表皮蠟質不僅能夠調節植物體內的水分應對干旱、高溫等非生物脅迫，而且在限制非氣孔水分流失方面也一直起著至關重要的作用，其作為植物與病原菌的第一個接觸部位，是植物的物理屏障，不僅能夠限制病原菌的入侵，而且在植物抗細菌、真菌和昆蟲病害中發揮了多重作用，因此植物表皮蠟質對植物的生長和發育起著重要的作用。

脂肪酸去飽和酶(FAD)是一種能夠催化脂肪酸鏈特定位置使其形成雙鍵，以此來產生不飽和脂肪酸的酶類［1］。不飽和脂肪酸根據雙鍵個數的不同分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸［2］。根據雙鍵的位置及其功能的不同，又可以將多不飽和脂肪酸分為ω-6系列和ω-3系列［3］。不飽和脂肪酸是植物膜脂的主要結構成分，在大多數植物中其含量可達到75%以上［4］。從橄欖(Olea europaea cv.)中分離到3個編碼微粒體油酸脫氫酶FAD2的cDNA序列，序列分析和相應cDNA在酵母中的功能表達證實它們編碼微粒體油酸脫飽和酶。基因表達和脂類分析表明，OeFAD2基因家族成員在亞油酸生物合成方面具有特殊的生理作用，既存在于構成橄欖油的貯藏脂質中，也存在于參與響應非生物脅迫的膜脂中［5］。FAD2基因在植物的不同組織中表達不同，FAD2的過表達修飾了生理和營養特性。由于FAD2的活性導致二烯脂肪酸的含量增加，二烯脂肪酸含量的增加可以提高植物抗寒冷和鹽脅迫的能力，所以針對FAD2基因的研究對于提高植物抗逆性具有重要意義。

花花柴（Karelinia caspia），是菊科花花柴屬多年生草本植物，在國內外分布廣泛，多生于干旱、半干旱地區的河谷沖積平原及沙質草甸鹽土地［6］。花花柴作為重要的防風固沙植物，具有耐鹽堿、耐干旱、耐高溫以及耐沙埋等生理特性，是一種改善荒漠地區生態平衡的重要植物［7］。

本試驗通過對常溫-高溫處理下的花花柴葉片進行轉錄組分析及測序，從而挖掘花花柴耐高溫相關基因及生物學路徑，從基因轉錄水平揭示花花柴響應高溫脅迫的分子機制［8］，為耐高溫分子育種提供基因資源理論和參考依據。并通過將花花柴外源基因KcFAD2轉入煙草，對轉基因材料進行生理指標等測定，以進行其抗逆性的相關驗證。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

新鮮花花柴采自于塔里木大學校園內人工綠地（40°36′N，80°57′E），煙草種子‘K326’、大腸桿菌TOP10、根癌農桿菌GV3101、超表達載體pK2GW 7.0以及用于亞細胞定位實驗的載體pGWB406、輔助質粒p19和核、膜Marker菌液等均由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室贈送。

1.2 花花柴蠟質合成相關基因的篩選

通過實驗室前期常溫-高溫比較轉錄組測序，得到有注釋的差異表達基因13 593個（差異表達倍數＞2），通過選取與花花柴耐高溫能力關系密切的角質、軟木脂和蠟質生物合成路徑的差異表達基因Kc-FAD2，Oleoyl-CoA在KcFAD2的催化下參與生成Linoleoyl-CoA。

1.3 花花柴蠟質合成相關基因KcFAD2的亞細胞定位實驗

KcFAD2的引物序列如表1所示，將PCR產物通過BP-LR反應連接到pGWB406載體上，該載體在35S啟動子后N端含有EGFP蛋白。電轉得到含有目的基因的農桿菌GV3101菌液，然后按照基因菌液∶Marker∶P19為2∶1∶1的比例混合，注射進1月齡的本氏煙草葉片背面，不同樣品各做3次重復，暗培養24 h后見光培養48 h，使用FV1200激光共聚焦顯微鏡（Heidelberg公司）進行觀察。

表1 KcFAD2引物序列

1.4 植物表達載體構建及煙草遺傳轉化

設計BPLR反應引物，用TA克隆質粒作為模板進行PCR反應并做膠回收。利用BP反應試劑盒根據同源重組的原理將KcFAD2構建到中間載體Pdoner221上，通過轉化大腸桿菌TOP10，篩選陽性菌落并提取重組質粒。將上述BP反應的重組質粒利用LR反應試劑盒通過同源重組的原理構建到植物表達載體pK2GW7上，并轉化至大腸桿菌TOP10中，篩選陽性菌落后，提取質粒pK2GW7-KcFAD2。利用電轉化法將質粒pK2GW7-KcFAD2轉化至農桿菌GV3101中，篩選陽性菌落后擴大培養，用于后續進行農桿菌介導的煙草遺傳轉化實驗［9-10］。

1.5 轉基因煙草鑒定

使用CTAB法提取轉基因煙草的基因組DNA，以基因組DNA作為模板進行花花柴KcFAD2基因的陽性檢測PCR，以野生型煙草K326基因組DNA作為陰性對照，將含有GV3101-KcFAD2質粒的農桿菌作為陽性對照，用瓊脂糖凝膠電脈法進行檢測。T0代具體的檢測方法參考陳駱等［11］研究方法。

1.6 轉基因煙草表達量檢測

按照天根公司試劑盒說明書（RNA Easy Fast，TIANGEN公司）提取轉基因煙草幼嫩葉片的RNA，按試劑盒（cDNA反轉錄試劑盒，Novoprotein公司）說明書配置體系放入反轉錄儀中，得到煙草cDNA，以提取出的轉基因煙草樣品的cDNA為模板，稀釋100倍用作Real-Time模板，煙草HSC70-1為內參基因［12］，設計KcFAD2的 Real-Time PCR 引物（表1），所有處理4次重復，配置20 μL體系，用實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）進行擴增，檢測基因的表達量。將結果導入Microsft Office Excel 2016軟件中，用POWER函數對CT值進行數據分析，函數為：POWER(number，power)，其中參數number表示底數；參數power表示指數，計算公式使用2-△△Ct法，得到轉基因煙草表達量數據。

1.7 轉基因植株高溫脅迫及脯氨酸和可溶性糖含量測定

將9周齡的轉基因煙草和陰性對照在42℃的培養箱中進行高溫脅迫處理，做5次生物學重復，期間保持濕度。10 h后取樣拍照，植物可溶性糖用試劑盒（Plant Soluble Sugar Content Assay Kit，boxbio公司）提取。脯氨酸含量用試劑盒（Proline Content Assay Kit，Boxbio公司）提取，分別將提取后的溶液點于酶標板，置于多功能酶標儀（Enspire公司）上檢測，記錄數據，得到轉基因植株脯氨酸和可溶性糖含量數據圖。

1.8 轉基因植株高溫脅迫后蠟質含量的測定

將9周齡的轉基因煙草裁剪成1 g的葉片，先用天平稱出質量，再用20 mL三氯甲烷溶液漂洗20 s，將所得溶液過濾到已知質量的培養皿中，可得到蠟質質量與葉片質量的比值即為蠟質含量，重復3次取平均值，同樣的方式得到高溫處理后葉片的蠟質含量［13］。

1.9 數據分析

使用 Microsoft Office Excel 2016、Microsoft Office Word、IBM SPSS Statistics 23及 Adobe Photoshop 2021軟件進行圖片制作與數據處理。

2 結果與分析

2.1 KcFAD2基因的克隆與序列分析

通過RT-PCR技術克隆花花柴KcFAD2基因的CDS全長序列，分析結果表明其編碼384個氨基酸，與NCBI數據庫中多種植物的FAD2均具有較高的同源性，與向日葵（Helianthusannuus）的相似性最高，達90.86%，同時因為花花柴簡稱為Kc，因此命名為Kc-FAD2，基因的登錄號為MW528401。

2.2 KcFAD2基因的亞細胞定位結果

如圖1所示，通過亞細胞定位結果分析可知，綠色熒光主要存在于細胞膜上，其他部位并未出現綠色熒光，且能夠與膜Marker（CBL1:RFP）的紅色熒光發生共定位，表明該基因的表達產物定位在細胞膜上，為膜定位蛋白。

圖1 KcFAD2的亞細胞定位分析

2.3 KcFAD2轉基因煙草的轉化及鑒定

通過遺傳轉化試驗共獲得KcFAD2陽性轉基因煙草10株，基因組DNA陽檢結果顯示如圖2A。Kc-FAD2基因在陽性轉基因煙草中的表達量如圖2B所示，轉基因煙草的遺傳轉化過程如圖2C所示，選取表達量較高的陽性植株進行后續抗性鑒定。

圖2 KcFAD2轉基因煙草的轉化及鑒定

2.4 KcFAD2轉基因煙草耐高溫性鑒定

由于KcFAD2基因是從花花柴高溫脅迫后的轉錄組中篩選出的上調表達基因，故本研究對該基因的耐高溫性進行了研究。42℃高溫處理前轉基因煙草如圖3A所示，42℃高溫處理10 h后轉基因煙草如圖3B所示，WT煙草處理后呈明顯萎蔫狀態，而轉入KcFAD2基因的煙草無明顯改變，恢復正常溫度后長勢良好。

圖3 KcFAD2轉基因煙草和WT轉基因煙草高溫處理前后對比

圖4是對高溫脅迫下的野生型和KcFAD2轉基因煙草的脯氨酸含量、可溶性糖含量等生化指標測定。分析可知，在42℃高溫處理10 h后，轉基因煙草 K6-5、K6-6、K6-8、K6-10、K6-12脯氨酸含量顯著高K6-WT煙草(圖4A)；轉基因煙草K6-5、K6-6、K6-8、K6-10、K6-12可溶性糖含量顯著高于K6-WT煙草(圖4B）。結果表明，轉KcFAD2基因煙草在高溫脅迫后，能積累更多的可溶性糖和更多的脯氨酸。

圖4 轉基因煙草42℃處理10 h后脯氨酸含量和可溶性糖含量變化分析

2.5 KcFAD2轉基因煙草高溫處理前后蠟質含量測定結果

如圖5所示，在42℃高溫處理10 h后，KcFAD2轉基因煙草的蠟質含量均有提升，其中K6-5、K6-6、K6-8、K6-10、K6-12在高溫處理后蠟質含量顯著上升，這可能與高溫促進了蠟質合成相關基因KcFAD2編碼蛋白合成有關，進而提高了煙草葉片的蠟質含量。

圖5 轉基因煙草在42℃處理10 h后蠟質含量的變化

3 討論

全球氣候變暖會加劇氣候事件的嚴重程度，高溫作為非生物脅迫嚴重影響我國作物生產［14］，因此提高作物的耐高溫性顯得尤為重要。花花柴作為荒漠植物，具有良好的耐高溫、抗干旱的優點，其中表皮蠟質發揮了重要的作用，表皮蠟質不僅具有防止外力損傷的作用，還可以抵抗外界脅迫。蠟質在植物抗細菌、真菌和昆蟲病害中也發揮了多重作用［15］。因此本試驗以克隆花花柴蠟質合成相關基因作為外源基因，構建超表達載體利用農桿菌介導法轉入植物體內進行遺傳轉化，以期改善作物應對逆境脅迫的能力。

FAD2基因在植物的不同組織中表達不同，FAD2的過表達不僅修飾了生理和營養特性，其活性也導致二烯脂肪酸的含量增加，因此增加了抗寒冷和鹽脅迫的能力［16］，所以針對FAD2的研究對于提高植物抗逆性有重要意義。由于本研究的基因KcFAD2是從花花柴常溫-高溫對比的RNA-seq數據中篩選出的差異表達基因，故選取的處理方式是高溫脅迫處理，42℃高溫脅迫處理10 h后的KcFAD2轉基因煙草在植株外在表觀、可溶性糖含量、脯氨酸含量的表現均優于陰性對照WT煙草。綜合來看，糖類物質是構成植物體重要組成成分之一，不僅是新陳代謝的主要原料和貯存物質，也可作為轉移介質、功能分子和調節因子等調控植物的生長和發育［17］，結果表明Kc-FAD2基因上調表達可以促進可溶性糖含量的提升；脯氨酸在穩定生物大分子結構、降低細胞酸性、解除氨毒、調節細胞氧化還原勢以及提高植物的抗逆性等方面起重要作用［18］，從測得的數據分析可知Kc-FAD2轉基因表達量高的植株脯氨酸含量也高。在KcFAD2轉基因材料中，發現表達量最高的株系K6-6的脯氨酸含量以及可溶性糖含量均高于其他陽性植株，因此推測KcFAD2轉基因材料面對高溫脅迫能力的提升與脯氨酸含量提高和可溶性糖含量上升有關。同時在李銘楊等［19］研究大豆GmGolS1基因轉化煙草的試驗中也存在表達量高的植株抗逆表現高于表達量低的植株的現象，因此推測轉基因煙草對高溫脅迫能力與KcFAD2基因的表達量呈正相關的趨勢。蠟質在植物非生物和生物脅迫耐受中起著重要作用，并且與過度紫外線輻射、高溫、細菌和真菌病原體、昆蟲、高鹽度和低溫的防御機制有關［20］。本試驗也對高溫處理前后的轉基因煙草進行了蠟質含量的檢測，發現蠟質含量在處理后普遍上升，由于在花花柴高溫表達譜中KcFAD2基因一直為上調表達，推測高溫促進了蠟質合成相關基因KcFAD2編碼蛋白的合成，進而導致葉片蠟質含量的上升。

4 結論

本研究結果表明，KcFAD2可以提高煙草抵抗高溫脅迫的能力，并且抵抗高溫脅迫的能力與基因的表達量為正相關，表達量越高，抵抗高溫脅迫的能力越強，同時可以促進葉片蠟質含量的升高。但由于轉基因植株在抗逆鑒定中表現出來的抗逆性僅為初步的研究結果，所以還需要在后代中做進一步的抗逆鑒定。