低溫脅迫對軍曹魚幼魚血清生化指標、肝臟抗氧化酶活性及凋亡相關基因表達量的影響

李 豫，黃建盛，陳有銘，溫震威，歐光海，黃鑒鵬，蔣鑫濤，郭潮安，馬 騫，陳 剛,3

(1.廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2.廣東藍糧種業有限公司，廣東 湛江 524000；3.廣東省水產動物病害防控與健康養殖重點實驗室，廣東 湛江 524088）

溫度是影響魚類生長、發育和繁殖的主要環境因子。溫度驟降對魚類正常生命活動產生不利影響，甚至導致魚類大量死亡。尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[1]、雜交石斑魚（Epinephelus moara♀×Epinephelus lanceolatus♂）[2]、點帶石斑魚（Epinephelus coioides）[3]、鯉（Cyprinus carpiovar.wuyuanensis♂×Cyprinus pellegrini pellegrini♀）[4]等在低溫脅迫下，葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）和谷丙轉氨酶（ALT）等血清生理生化指標均發生顯著變化。此外，低溫脅迫還會導致魚體內源性活性氧（ROS）增加，造成氧化損傷[5]。將斑馬魚（Danio rerio）和歐洲綿鳚（Zoarces viviparus）直接轉入低溫環境中導致腦和肝臟發生氧化損傷[6-7]，長期處于低溫脅迫的濱岸護胸鲇（Teleostei callichthyidae）和歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）中也出現類似情況[8-9]。魚類通過抗氧化防御系統中的過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶消除ROS。當ROS含量超出機體清理能力范圍時，將引起氧化應激反應，導致細胞膜損傷、酶失活以及遺傳物質等重要細胞成分受損[10-11]。氧化應激可進一步誘導細胞凋亡[12]。大多數凋亡信號轉導過程與caspase家族、p53、mdm2、bax和bcl-2等凋亡相關基因有關，關鍵凋亡相關基因表達量的變化可降低細胞活力，增加細胞凋亡比例[13-14]。

軍曹魚（Rachycentron canadum）營養豐富，肉質鮮美，經濟價值高，是近海浮動式網箱和深海網箱的重要養殖魚種[15]。據報道，軍曹魚適宜生長水溫為25～32℃，水溫低至21 ℃時攝食量明顯降低，18 ℃時靜止于水底[16]。近年來，我國南方地區冬春季節寒潮天氣頻發，對軍曹魚養殖業造成一定的經濟損失。本實驗室前期開展了低溫脅迫影響軍曹魚幼魚脂代謝的相關研究，發現軍曹魚通過顯著提高肝臟和腹腔脂肪的多不飽和脂肪酸比例來響應低溫脅迫[17]。本研究測定低溫脅迫下軍曹魚的血清和肝臟生理生化指標，檢測肝臟中凋亡相關基因表達量的變化，為軍曹魚健康養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及實驗設計

實驗用軍曹魚幼魚由廣東海洋大學海洋生物研究基地自繁自育，實驗在廣東恒興飼料股份有限公司863 基地進行。實驗開始前將幼魚暫養兩周，養殖設備為24 h 的流水養殖系統，每個水槽300 L，溶氧水平≥5 mg/L，氨氮≤0.02 mg/L，pH 7.6±0.2，溫度（28±1）℃、鹽度29±1。暫養結束后挑選健康、規格一致、平均體質量（39.11±1.01）g、平均體長（19.71±0.73）cm 的軍曹魚進行實驗。實驗設置(18±0.5)、(21±0.5)、(25±0.5)℃3 個溫度處理組和1個對照組（28±1）℃，每組3個重復，每個重復20尾魚。降溫程序參考文獻[18-20]并適當調整，水溫高于23℃時以6 h/℃勻速降溫，降至23℃后以12 h/℃勻速降溫。溫度處理組，將冰塊置于4層蝦苗袋，密封，放入水槽，水槽上方覆蓋薄膜，并在水槽周圍粘貼隔熱棉以減少溫度波動；使用氣石連續充氣保證水體溫度均衡；實驗期間24 h連續監測溫度值（每2 h測量一次水溫），當水溫偏離0.3 ℃以上時即調整冰塊數量。實驗期間低溫處理組靜水養殖，每天在8:00和17:00投喂飼料（廣東東騰飼料有限公司），每天更換50%的等溫海水，除水溫外，其余水質條件與暫養期間保持一致。

1.2 樣品采集

當溫度處理組水溫降至指定溫度（25±0.5、21±0.5、18±0.5）℃后，在0、4 和7 d 時每組隨機取魚15尾（每個重復5 尾），使用40 mg/L 的丁香酚麻醉，用1 mL 注射器尾靜脈處采血，離心（3 500 r/min，15 min，4℃）取上層血清置-80 ℃冰箱中保存，用于檢測生理生化指標；采血后每組隨機取12尾，6尾魚肝臟用于酶活測定，6 尾魚肝臟用于基因表達分析。所取組織經液氮速凍后置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.3 血清生理生化指標及肝臟酶活測定

血清葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇（T-CHO）、總蛋白（TP）、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（AKP）指標使用全自動分析儀測定（Chemray 240，深圳雷杜生命科技），所用試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。肝臟過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性和丙二醛（MDA）含量均用南京建成生物工程有限公司試劑盒，參照試劑盒說明書測定。

1.4 基因表達分析

肝臟總RNA 提取、質量檢測、反轉錄操作流程均參照文獻[21]。根據軍曹魚已有的全基因組數據（NCBI BioProject ID:PRJNA634421）查找目的基因序列，使用Primer Premier 6.0 設計實時熒光定量PCR（qRT-PCR）引物（表1）。以獲得的肝臟cDNA為模板，β-actin為內參基因，通過qRT-PCR 分析bax、bcl-2、caspase-9、caspase-3、p53、mdm2基因在不同溫度條件下的表達變化。qRT-PCR 反應程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s、58 ℃15 s、72 ℃10 s，40循環。用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 熒光定量引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.5 數據分析

實驗數據采用單因素方差分析和Duncan's 法多重比較進行顯著性差異分析，P ＜0.05 表示差異顯著，采用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結果

2.1 低溫脅迫對軍曹魚幼魚血清生化指標的影響

圖1 可見，脅迫0 d 時，18 ℃組血清GLU 含量顯著高于其他組（P ＜0.05）；4、7 d 時，28 ℃組GLU含量顯著高于溫度處理組（P ＜0.05）（圖1(A)）。18 ℃組血清TG 含量在各個時間點均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖1(B)）。21 ℃和18 ℃組T-CHO 含量在各個時間點均顯著低于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖1(C)）。0、4 d 時，組間血清TP含量無顯著性差異（P ＞0.05）；7 d時，21℃和18℃組TP 含量均顯著低于28℃和25℃組（P ＜0.05）（圖1(D)）。

圖1 低溫脅迫對軍曹魚幼魚血清葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇和總蛋白含量的影響Fig.1 Effects of low-temperatures on contents of glucose(GLU),triglyceride(TG),total cholesterol(T-CHO)and total protein(TP)in serum of juvenile cobia

2.2 低溫脅迫對軍曹魚幼魚血清酶活性的影響

圖2 可見，脅迫0、4 d 時，18 ℃組血清ALT 活性顯著高于其他組（P ＜0.05）；7 d 時，18 ℃組ALT 活性下降且組間無顯著差異（P ＞0.05）（圖2(A)）。0 d時，28 ℃組血清AST活性顯著低于溫度處理組（P ＜0.05）；4 d 時，21 ℃和18 ℃組AST 活性均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05），而在7 d 時，僅21 ℃組顯著高于其他組（P ＜0.05）（圖2(B)）。0、4 和7 d時，血清AKP 活性在28 ℃和25 ℃組較穩定，21 ℃和18 ℃組分別在4 d 和7 d 達到峰值并顯著高于其他組（P ＜0.05）（圖2(C)）。

圖2 低溫脅迫對軍曹魚幼魚血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和堿性磷酸酶活性的影響Fig.2 Effects of low-temperatures on activities of alanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST)and alkaline phosphatase(AKP)in serum of juvenile cobia

2.3 低溫脅迫對軍曹魚幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

圖3 可見，在0、4、7 d 時，28 ℃和25 ℃組肝臟SOD 活性較穩定且顯著高于21 ℃和18 ℃組（P ＜0.05）（圖3(A)）。0 d 時，28 ℃組肝臟CAT 活性顯著高于溫度處理組（P ＜0.05）；4、7 d 時，28 ℃和25 ℃組肝臟CAT 活性顯著高于21 ℃和18 ℃組（P ＜0.05）（圖3(B)）。0 d 時，18 ℃組肝臟GPx 活性顯著高于其他組（P ＜0.05）；21 ℃和18 ℃組GPx 活性在4 d 時顯著高于28 ℃和25 ℃組，而在7 d 時，則顯著低于后者（P ＜0.05）（圖3(C)）。7 d時，21 ℃和18 ℃組肝臟MDA 含量均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖3(D)）。

圖3 低溫脅迫對軍曹魚幼魚肝臟超氧化物歧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性及丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of low-temperatures on activities of SOD,CAT,GPx and contents of MDA in liver of juvenile cobia

2.4 低溫脅迫對軍曹魚幼魚肝臟凋亡基因相對表達量的影響

圖4 可見，在0、4 和7 d 時，21 ℃和18 ℃組肝臟caspase-3和caspase-9基因表達量均顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖4(A,B)）。28 ℃組肝臟p53和bax基因表達量均顯著低于溫度處理組（P ＜0.05）（圖4(C,F)）。脅迫0 d 時，25 ℃和18 ℃組肝臟mdm2基因表達量顯著高于28 ℃和21 ℃組（P ＜0.05）；脅迫4、7 d 時，21 ℃和18 ℃組mdm2基因表達量顯著高于28 ℃和25 ℃組（P ＜0.05）（圖4(D)）。脅迫0、7 d 時，25 ℃組肝臟bcl-2基因表達量顯著高于其他組，18 ℃組顯著低于其他組（P ＜0.05）；脅迫4 d 時，25 ℃組顯著高于21 ℃和18 ℃組（P ＜0.05）（圖4(E)）。

圖4 低溫脅迫對軍曹魚幼魚肝臟組織凋亡相關基因caspase-3、caspase-9、p53、mdm2、bcl-2和bax表達量的影響Fig.4 Effect of low-temperatures on relative expression of genes caspase-3,caspase-9,p53,mdm2,bcl-2 and bax in liver of juvenile cobia

3 討論

3.1 低溫脅迫對軍曹魚幼魚代謝水平的影響

血液是魚體內循環系統的重要組成部分，具有生理調節、生理防御和物質運輸等功能，其生理生化指標直接反映魚類的營養狀況和代謝水平[22]。GLU 為機體主要的能源物質，是魚類維持正常生命活動的能量直接來源[23]。本研究中，軍曹魚幼魚血清GLU 含量在18 ℃和21 ℃水溫脅迫下呈先升高后降低的趨勢，這與鯉（Cyprinus carpio）[4]的低溫脅迫結果相似，其原因可能是低溫處理初期魚體內大量肝糖原轉化為GLU以滿足機體的代謝需求，而后大量GLU 分解成ATP 為機體提供能量以抵御低溫環境[4]。TG 和T-CHO 作為血脂的主要成分[24]，為魚體提供能量并維持體溫，可作為衡量脂代謝的指標[25]。在18 ℃和21 ℃水溫脅迫下幼魚血清TG 含量顯著高于對照組，與本實驗室前期開展的軍曹魚低溫脅迫研究結果一致，推測低溫脅迫會誘導魚體合成更多的脂肪酸以抵御寒冷[17]。低溫脅迫下魚體肝臟會受到損傷，導致與合成T-CHO 相關的酶活性受抑制，使T-CHO 合成速度減慢，同時肝臟損傷導致其代謝功能障礙，T-CHO 不能正常通過肝腸循環被肝臟重新吸收，進而引起血清T-CHO含量降低[22]。本研究中，軍曹魚幼魚在低溫脅迫后血清T-CHO 含量降低，推測與低溫導致其在幼魚體內合成速度下降及其在肝腸循環中代謝異常有關。

血清蛋白質水平可反映魚體健康狀態，TP具有穩定血液膠體滲透壓和酸堿度的作用[26]。褐籃子魚（Siganus fuscescens）[27]和七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus）[28]的血清TP 含量隨著低溫作用強度的增強呈降低的趨勢。本研究中，軍曹魚幼魚血清TP 含量在18℃和21℃水溫脅迫到7 d 時顯著低于對照組，推測長時間低溫脅迫可能造成肝臟功能受損，蛋白質合成速率下降[28]；此外，低溫脅迫后期幼魚攝食量明顯減少，也可能導致血清蛋白水平下降。

3.2 低溫脅迫對軍曹魚幼魚肝功能及免疫的影響

魚類血清酶活性變化可作為判斷組織器官的狀態和代謝水平的依據[29]。ALT 和AST 是可用于指示肝細胞損傷及其程度的轉氨酶。機體處于正常狀態時肝細胞結構完整，僅少量轉氨酶進入血液，當肝細胞損傷時細胞膜通透性改變，大量ALT和AST 被釋放到血液中，導致其活性在血液中迅速升高[30]。在云紋石斑魚（Epinephelus moara）的低溫脅迫實驗中，血清ALT 和AST 活性顯著高于對照組[31]，符合上述規律。本研究中，低溫脅迫引起軍曹魚幼魚ALT 和AST 活性顯著升高，脅迫7 d 時降至對照組水平，可能是低溫脅迫前期肝臟合成轉氨酶過程沒有受到抑制，肝臟受損后大量轉氨酶進入血清，而在脅迫7 d 幼魚響應低溫刺激時合成轉氨酶的過程受到抑制，使血液中轉氨酶含量呈下降趨勢[2]。

AKP 是魚類重要的防御因子，廣泛參與到免疫活動中，血清AKP 活性可作為評價機體免疫能力、代謝水平的指標[32]。機體代謝異常時AKP 通過淋巴道和肝竇釋放到血液中，造成血清AKP 活性升高[28]。本研究中18 ℃和21 ℃水溫脅迫7 d 時軍曹魚幼魚血清AKP活性顯著高于對照組，推測低溫脅迫對軍曹魚幼魚的免疫機制或代謝造成損傷。

3.3 低溫脅迫對軍曹魚幼魚抗氧化防御系統的影響

生物機體在環境刺激下會產生大量ROS，而過量的ROS 則會造成DNA、蛋白質和脂質的功能受損[33]。魚體抗氧化防御系統中，抗氧化酶SOD、CAT、GPx 和部分非酶類抗氧化劑可相互協調清除ROS，防止或修復氧化損傷[34]。研究表明，魚類抗氧化系統易受溫度影響，大口黑鱸（Micropterus salmoides）長期處于溫度脅迫狀態會造成應激損傷并降低免疫水平[35]；對中華鱘（Acipenser sinensis）進行急性低溫脅迫后其氧化酶活性改變并對肝臟產生一定程度的損傷[36]；點籃子魚(Siganus guttatus)幼魚肝臟抗氧化酶活性在低溫脅迫（14 ℃）后顯著降低[37]；在云紋石斑魚[38]和尼羅羅非魚[39]的研究中發現，低溫脅迫導致魚體內MDA 濃度升高，從而對魚體造成傷害。本研究中，18 ℃和21 ℃組軍曹魚幼魚肝臟SOD 和CAT 活性在脅迫期間均顯著低于對照組，其原因可能是低溫脅迫造成肝功能受損，抗氧化防御能力降低，從而導致SOD 和CAT 活性下降。而GPx 活性在低溫脅迫至7 d 時顯著高于對照組，可能是脅迫后期CAT 活性下降誘導GPx活性上升以清除過量的H2O2[40]。MDA 含量在脅迫期間均顯著高于對照組，表明低溫脅迫下軍曹魚幼魚抗氧化防御能力遭到破壞，機體無法及時清除過量的ROS，體內ROS 濃度上升使脂質過氧化程度加深。

3.4 低溫對軍曹魚幼魚肝臟組織凋亡基因相對表達量的影響

細胞應對刺激有不同的保護機制，但超出細胞承受范圍的刺激強度會導致細胞信號中斷、DNA 結構破壞和細胞凋亡[12]。研究表明，氧化應激會改變caspase家族、p53、mdm2、bax和bcl-2等凋亡相關基因表達水平，進而誘導細胞凋亡[13]。細胞應激產生的ROS 會改變p53表達水平，進而啟動細胞周期停滯或凋亡程序[41]。p53為信號網絡中心樞紐，可調控細胞的活性，其中p53-mdm2信號通路是主要的調控途徑[42]。mdm2在調控p53表達水平、維持機體的穩態發揮著重要作用，p53被激活后促進mdm2表達，mdm2表達產物對p53具有負調控作用[43]。本研究中，18 ℃和21 ℃水溫脅迫導致軍曹魚幼魚p53表達量顯著高于對照組，提示p53可能在低溫誘導幼魚細胞凋亡中起關鍵作用，其表達量變化可能啟動細胞凋亡程序，同時mdm2的激活可能是受p53表達上調的影響。

p53可通過上調bax和下調bcl-2表達誘導細胞凋亡。bax和bcl-2均屬bcl2家族，但基因功能完全不同[44]。研究表明，低溫脅迫導致四川華鳊（Sinibrama taeniatus）細胞凋亡，其凋亡相關基因p53和bax表達上調以及bcl-2表達下調，本研究檢測的基因表達趨勢與此結果相似，推測低溫脅迫下軍曹魚發生了細胞凋亡[45]。

細胞凋亡可由多種刺激觸發，但凋亡途徑主要有外源性死亡受體途徑和內源性線粒體途徑[46]。內源性線粒體途徑通過激活caspases-9啟動凋亡程序，caspases-9表達上調可以激活下游caspases-3促使細胞凋亡，caspases-3是兩種凋亡途徑的“執行者”。本研究中，在18 ℃和21 ℃水溫脅迫下軍曹魚幼魚肝臟caspases-9和caspases-3表達顯著高于對照組，說明低溫脅迫下最終激活caspases-3表達，進而激活內源性線粒體途徑引發細胞凋亡[47]。此結果與低溫脅迫下暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）[48]和點帶石斑魚[3]caspases-9和caspases-3表達顯著上調結果相似。魚類受到外來刺激時，會造成體內ROS 代謝紊亂，細胞組分及生物合成機制發生異常，進而可能誘發細胞凋亡[49]。推測可能是低溫脅迫軍曹魚幼魚過程中，抗氧化防御能力降低，細胞不斷受到氧化損傷，從而導致細胞凋亡[11]。

3.5 軍曹魚對低溫的敏感性

低溫脅迫顯著影響魚類生理過程，降溫速率對于魚類響應低溫脅迫過程的形態、生理、基因表達水平的變化有決定性作用；因此，需依據目標物種的溫度適應性等特征選取合適的降溫速率。例如，花鱸（Lateolabrax maculatus）[20]、七彩神仙魚（Symphysodon aequifasciatus）[19]、四帶無須鲃（Puntius tetrazona）[50]等分別選取1 ℃/h、1 ℃/d及2 ℃/d 的降溫速率開展低溫脅迫處理。軍曹魚廣泛分布在水溫較高的海域[51]，對低溫較為敏感，過快的降溫速率（2 ℃/h）會導致軍曹魚不攝食[17]，故本研究首先以6 h/℃勻速降溫至23 ℃后，再以12 h/℃勻速降溫。此外，上述研究中低溫處理組的首次取樣均選取在溫度降至目標溫度后開始，因此，本研究也采取相似的取樣策略，以保證研究結果的可比性。

4 結論

本研究表明，低溫脅迫會顯著抑制軍曹魚幼魚代謝水平，降低其抗氧化相關酶活性，造成氧化損傷，從而誘導凋亡相關基因表達，促進細胞凋亡。