耐低pH值納他霉素生產菌株的誘變選育

王鑫宇，許倍銘，劉陳夢，吳康，孫瑞杰，賈士儒，譚之磊

（天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

納他霉素是天然多烯大環內脂類抗生素，分子式為C33H47NO13，分子量為665.75[1]，含有4個共軛雙鍵的26元內酯環，可以與麥角甾醇基團結合，從而使真菌細胞膜變形[2]，進而引起菌內維持細胞生長的物質滲出，最終致使細胞死亡，但對細菌沒有抑制作用[3]。納他霉素難溶于水和油脂，很難被人體消化吸收，大部分攝入的納他霉素會隨糞便排出，因此具有很高的安全性[4-5]。由于納他霉素具有優良的抗菌性能，目前除在焙烤食品、乳酪制品、易發霉食品等食品行業上應用外[6-7]，在醫藥工業、飼料工業等領域也得到了越來越多的重視，臨床上現已用于治療皮膚真菌感染疾病、真菌性眼角膜炎等[8-9]。

褐黃孢鏈霉菌是主要的納他霉素生產菌之一，褐黃孢鏈霉菌在發酵前期pH值快速下降，但酸性條件不利于菌體生長和納他霉素生產[10]。因此篩選耐受低pH值的菌株不僅有利于納他霉素生產，也有利于在實際生產中減少耗堿量，降低生產過程中粗放操作對發酵產量造成的影響。Zhang等[11]等以干酪乳桿菌為出發菌，在pH4.3的酸性條件下適應性進化70 d得到的進化株，搖瓶發酵64 h，生物量較出發菌提高60%以上。Nyabako等[12]通過常壓室溫等離子體誘變結合酸適應進化，有效提高了嗜酸乳桿菌的耐酸能力。突變株LAartp-ale2在pH3.0和pH2.5的酸性條件下存活率顯著提高。目前影響鏈霉菌耐酸性的相關報道較少。但在部分革蘭氏陽性菌中已有研究表明[13]，胞內質子（H+）的去除，細胞膜組分改變及胞內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量等都會影響菌株的耐酸能力，通過將胞內H+排出胞外可以維持胞內pH值穩態，從而保證菌體在酸性環境中的正常生長，而這一過程需要ATP提供能量。此外ATP通常作為微生物生長和生物合成有用物質所必需的能量來源，納他霉素生物合成酶的作用的發揮需要ATP提供能量[14]。

本試驗以褐黃孢鏈霉菌S.gilvosporeus TUST01為出發菌，通過誘變育種結合合理地篩選方式，獲得耐低pH值突變菌株S.gilvosporeus Y-10，并對其耐酸機制進行研究。以期為降低納他霉素生產成本，研究鏈霉菌耐酸機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

甲醇（色譜純）、氯仿（分析純）：康科德科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：博歐特化工貿易有限公司；葡萄糖（分析純）、磷酸鹽緩沖液（分析純）、ATP檢測試劑盒：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 菌株

納他霉素原始生產菌株Streptomyces gilvosporeus TUST01：天津科技大學生化工程實驗室保存。

1.3 培養基

種子培養基：淀粉10 g，葡萄糖10 g，黃豆餅粉10 g，蛋白胨 6 g，玉米漿 6 g，硫酸鎂 1 g，磷酸二氫鉀0.5 g，氯化鈉2 g，碳酸鈣5 g，加水定容至1 L，調節pH值為7.0。

發酵培養基：葡萄糖40g，淀粉30g，牛肉膏10g，黃豆餅粉15g，酵母抽提物0.3g，蛋白胨6.3g，MgSO4·7H2O 1.0g，NaCl2g，加水定容至1L，調節pH值為4.4和7.4。

斜面培養基：淀粉10g，葡萄糖10g，黃豆餅粉10g，酵母粉3 g，麥芽粉3 g，硫酸鎂1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鈉2 g，碳酸鈣3 g，瓊脂20 g，加水定容至1 L，調節pH值為7.0。

低pH值固體篩選培養基為斜面培養基，pH值調整為4.0。

以上培養基均使用121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.4 儀器與設備

BASIC紫外分光光度計：德國Eppendorf公司；SBA-400E生物傳感分析儀：山東省科學院生物研究所；BIOTECH-5BG-7000A 5 L發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；ARTP-Ⅱ常壓室溫等離子體誘變系統：北京思清源生物科技有限公司；Infinite 200PRO多功能酶標儀：帝肯貿易有限公司。

1.5 方法

1.5.1 菌株活化

在超凈臺中無菌條件下打開保藏菌種干粉的安瓿管，在其中加入1mL0.9%無菌生理鹽水，使用移液槍吹吸使菌種干粉在生理鹽水中混合均勻。吸取200 μL菌液加入到100 mL種子培養基中，平行3份。將種子培養基在28℃、220 r/min的搖床中培養48 h。

使用無菌接種環在菌種的復蘇種子培養基中挑菌，在固體培養基平板上三區劃線，平行3份，29℃恒溫培養5 d～7 d直至菌種表面產生孢子。

1.5.2 常壓室溫等離子體誘變（atmospheric and roomtemperature plasma，ARTP）

用無菌生理鹽水沖洗S.gilvosporeus TUST01斜面上生長良好的孢子，置于裝有玻璃珠的250 mL三角瓶中，220 r/min振蕩打散30 min后用濾膜過濾，調整孢子懸浮液濃度約為108CFU/mL。取10 μL孢子懸浮液于無菌金屬載片上，放置于ARTP-Ⅱ常壓室溫等離子體誘變系統處理臺座，在電源功率40 W，照射距離2 mm，氣流量10 L/min條件下對菌懸液進行50 s的誘變處理[15]，此時致死率為90%（正突變率最高）[16]。照射后，將金屬載片放入裝有1 mL無菌生理鹽水的離心管中振蕩1 min，再用生理鹽水稀釋后涂布于pH4.0的低pH值篩選平板，29℃培養5 d～10 d至突變株單菌落孢子絲生長良好。

1.5.3 耐酸菌株篩選

將pH4.0篩選平板上的突變株接種于24孔深孔板，每孔含3 mL種子培養基，用透氣封板膜密封后28℃，220 r/min于搖床振蕩48 h。之后取培養液以8%接種量接種于同樣的裝有3 mL發酵培養基的24孔深孔板中，搖床發酵96 h后吸取200 μL發酵液于96孔板中，4 000 r/min離心10 min，之后取40 μL上清液于新的96孔板中，以70%甲醇適當稀釋后置于酶標儀測定OD303值[17]，挑選OD303值較高的菌株進行平板驗證，并進行搖瓶復篩及5 L發酵罐驗證。

5 L發酵罐培養方法：初始裝液量3 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，28℃，220 r/min種子培養48 h，種子接種量15%，初始攪拌轉速200 r/min，罐壓0.1 MPa，通氣量1∶1，溫度28℃，關聯溶氧與轉速以控制溶氧量在30%，流加80%葡萄糖以控制葡萄糖含量為20 g/L。定時取樣測定發酵液的殘糖[18]、生物量[19]和納他霉素產量[20]。在此條件下通過控制不同的pH值條件以比較出發菌與篩選菌株的生長和納他霉素生產情況[21]。

1.5.4 遺傳穩定性

將復篩選出的菌株在斜面培養基上連續轉接15代，挑取各代菌株進行搖瓶發酵試驗，測定其生物量和納他霉素發酵產量[22]。

1.5.5 胞內ATP含量測定

根據ATP檢測試劑盒說明書的方法測定胞內ATP 濃度[23]。

1.5.6 細胞膜脂肪酸含量測定

參照Bo等[24]的方法，發酵液離心棄上清液后，用磷酸鹽緩沖液反復洗滌菌體細胞兩次，經液氮淬滅、提取液提取小分子物質、甲基化和硅烷化后，取上清液進行氣相色譜-質譜 （gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）檢測。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25μm）；升溫程序為進樣后70℃保持2min，以5℃/min的速度升溫到290℃，保持3min，再降溫到70℃。運行時間為52 min；載氣為高純氦氣，恒定流速為1 mL/min；接口溫度280℃。

質譜條件：電子轟擊電離；離子源溫度為250℃；離子電流為40 μA；電子轟擊能量為70 eV；掃描質量范圍 m/z為 50～800。

1.6 數據分析與統計

數據分析采用費舍爾最小顯著差異法，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 突變株的篩選

2.1.1 初篩

通過pH4.0篩選平板的篩選獲得了420株突變菌株。按照1.5.3中的24孔深孔板篩選方法，根據納他霉素產量篩選耐受pH4.4的菌株，耐低pH值菌株納他霉素產量散點圖見圖1。

圖1 耐低pH值菌株納他霉素產量散點圖Fig.1 Scatter plot of natamycin yield of strains with low pH resistance

由圖1可知，206株突變株的納他霉素與出發菌有顯著差異，即與出發菌納他霉素產量偏差超過±10%，突變率為49.05%。73株突變株較出發菌納他霉素產量提高，正突變率達17.38%。其中6株突變株納他霉素產量較高，菌株編號為Y-10，Y-226，Y-348，Y-354，Y-390以及Y-420，對6株菌株做進一步平板及搖瓶驗證。

2.1.2 篩選菌株平板生長驗證

對篩選菌株進行平板生長驗證，如圖2所示。

圖2 篩選菌株平板驗證圖Fig.2 Plate verification of screened strains

由圖2可知，篩選菌株中Y-10生長最為旺盛，此外Y-354，Y-390以及Y-420孢子發育良好，但菌落覆蓋范圍不完整。而Y-226與Y-348菌株外觀形態異常，菌絲生長緩慢。其中Y-226只長菌但孢子完全未萌發，而Y-348僅有部分區域孢子萌發且發育較差。可見篩選菌株中Y-10耐酸效果最好，結合其較高的納他霉素產量對Y-10進行進一步平板驗證，觀察其在pH4.4和pH7.4固體平板上不同培養時間的生長情況，結果見圖3。

圖3 Y-10與出發菌TUST01在不同pH值平板上的生長圖Fig.3 Growth of Y-10 and TUST01 at different pH plates

由圖3可知，出發菌在pH4.4的低pH值平板上不生長，而Y-10菌株生長旺盛，可見其具有較強的耐酸能力。此外，Y-10較出發菌在pH7.4的平板上培養前期生長更旺盛，到培養中期兩株鏈霉菌孢子發育良好，而到后期Y-10菌株孢子變灰而出發菌孢子偏灰白色。

2.1.3 搖瓶復篩

2.1.3.1 pH4.4搖瓶復篩

6株突變株在24孔深孔板低pH值發酵培養基篩選條件下納他霉素產量較高（圖1），對6株突變株進行pH4.4搖瓶復篩，結果見圖4。

圖4 耐低pH值菌株于pH4.4條件下納他霉素產量和生物量驗證Fig.4 Yield and biomass verification of the strain with low pH resistance at pH4.4 shaking flask

如圖4a所示，Y-10在pH4.4條件下納他霉素產量最高，于發酵132 h達最大值4.08 g/L，較出發菌TUST01提高48.36%。如圖4b所示，Y-10于搖瓶發酵生物量最大值為20.89 g/L，較出發菌提高42.11%，與納他霉素產量具有高度一致性。此外Y-226由于在平板上未產孢子，其在pH4.4搖瓶發酵條件下菌株難以生長，納他霉素產量極低。因此選擇Y-10作為優選耐酸菌株進行下一步研究。

將經過ARTP誘變及24孔深孔板初篩得到的在低pH值條件下納他霉素產量較高的Y-10菌株與出發菌TUST01在pH4.4搖瓶發酵培養基中pH值和殘糖進行比較，結果見圖5。

圖5 Y-10與出發菌TUST01于pH4.4條件下搖瓶發酵參數比較Fig.5 Comparison of shaking flask fermentation parameters between Y-10 and the original strain at pH4.4

圖5 a表明兩株菌在低pH值條件下pH值都呈現出先升高后降低再升高的趨勢，可能是由于發酵初期菌體出于滿足細胞生長的要求，通過自身代謝調整pH值至近中性（5.63～5.77）。之后菌體生長產酸導致pH值降低，但是降低幅度很小。最后菌體自溶，堿性物質流出導致pH值上升。圖5 b顯示出兩株菌的耗糖速度相當。由于Y-10較高的納他霉素產量和生物量，確定Y-10可以耐受低pH值的條件，為了達到后期篩選耐受低pH值菌株以及減少發酵過程中堿的消耗的目的，還需對Y-10進行pH7.4的正常搖瓶發酵驗證。

2.1.3.2 正常條件搖瓶復篩

對Y-10于pH7.4搖瓶條件下進行驗證，比較Y-10與出發菌納他霉素產量、生物量、pH值及殘糖變化，結果見圖6。

圖6 Y-10與出發菌正常搖瓶發酵參數驗證Fig.6 Verification of normal shaking flask fermentation parameters between Y-10 and the original strain

如圖6 a所示，Y-10納他霉素產量于發酵144 h達最高，為5.30 g/L，較出發菌株提高14.97%。如圖6 b所示，Y-10發酵前期生物量增長速度較出發菌快，生物量于發酵96 h達最大，為31.85 g/L，較出發菌株提高11.96%。如圖6 c所示，Y-10前期生物量快速提高，pH值隨之快速降低，于發酵24 h即降至最低5.26。此外Y-10較出發菌耗糖速度加快。說明Y-10在正常條件下顯示出了較強的生長活力。

2.2 5 L發酵罐驗證

2.2.1 不控制pH值條件下5 L發酵罐驗證

Y-10與出發菌28℃，220 r/min種子培養48 h后按照1.5.3中的5 L發酵罐培養方法，在不控制pH值條件下比較Y-10與出發菌pH值、生物量和納他霉素產量變化，結果見圖7。

圖7 Y-10與出發菌不控制pH值5 L發酵罐驗證Fig.7 Verification of 5 L fermenter between Y-10 and the original strain without controlling pH value

如圖7a所示，Y-10菌株pH值于發酵60 h自然降低至4.83，而出發菌于發酵36 h自然降低至4.64后開始上升，且整個發酵過程中Y-10整體pH值較出發菌更高，因此判斷Y-10可有效減少堿的消耗。如圖7b所示，Y-10在pH值自然變化條件下生物量明顯提高，生物量最高達到32.40 g/L，較出發菌提高56.22%。但圖7c所示納他霉素產量較出發菌明顯降低，納他霉素最高產量僅為5.58 g/L。Y-10生物量的提高再次證明了其較好的耐酸特性。繼續對Y-10控制pH6.3進行5 L發酵罐驗證，觀察其納他霉素產量和生物量等的變化。

2.2.2 控制pH6.3條件下5 L發酵罐驗證

對菌株Y-10與出發菌在初始pH7.4之后控制pH6.3條件下比較其納他霉素產量與生物量，并計算其耗堿量，結果見圖8。此外，Y-10在發酵過程中菌體異常上浮Y-10與出發菌正常條件下5 L發酵罐96 h取樣圖見圖9。

圖8 Y-10與出發菌正常條件下5 L發酵罐驗證Fig.8 Verification of 5 L fermenter between Y-10 and the original strain under normal conditions

圖9 Y-10與出發菌正常條件下5 L發酵罐96 h取樣Fig.9 Sample plot of Y-10 and the original strain at 96 h in the 5 L fermenter under normal conditions

如圖8 a所示Y-10發酵前期，生物量增長速度較出發菌更快，且到發酵后期生物量最大值較出發菌株提高10.65%。但如圖8 b所示，Y-10納他霉素積累遠低于出發菌且與不控制pH值的5 L發酵罐納他霉素產量接近。原因可能是Y-10在發酵過程中菌體異常上浮（圖9），導致菌體與培養基接觸面積小，不能充分利用碳源和氮源。在發酵過程中，需要通過流加2 mol/L氫氧化鈉維持pH值為6.3。整個發酵過程中，Y-10共耗堿290 mL，相較出發菌少消耗350 mL，說明Y-10可有效減少堿的消耗。

2.3 突變株Y-10的遺傳穩定性分析

采用斜面傳代方法將Y-10菌株進行連續15代的培養，再分別將活化的各代菌株在28℃搖床內發酵培養120 h，測定其納他霉素產量及生物量，結果見圖10。

圖10 Y-10遺傳穩定性驗證Fig.10 Verification of genetic stability of Y-10

如圖10所示，Y-10納他霉素產量在正常搖瓶條件下基本穩定在5.50 g/L左右（圖10 a），生物量穩定在31.00 g/L左右（圖10 b）。說明其生產性能穩定。

2.4 突變株Y-10耐酸機制

2.4.1 發酵過程中Y-10和出發菌胞內ATP比較

胞內ATP含量對于耐酸菌株的耐酸性能有重要影響，對Y-10與出發菌不同發酵時間的胞內ATP含量進行研究，結果見圖11。

圖11 Y-10與出發菌胞內ATP含量比較Fig.11 Comparison of intracellular ATPs between Y-10 and the original strain

如圖11所示，出發菌在發酵12 h～36 h，胞內ATP含量明顯提高，之后ATP水平趨于恒定。而Y-10在發酵過程中胞內ATP水平不斷提高，且始終高于出發菌。較高的胞內ATP水平可以為胞內H+轉運提供能量，并維持菌體在酸性環境下的正常生長。

2.4.2 菌株Y-10與出發菌脂肪酸含量比較

對Y-10與出發菌飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量進行研究，結果見圖12。

圖12 Y-10和出發菌不同脂肪酸相對含量Fig.12 Relative content of different fatty acids in Y-10 and the original strain

圖12結果表明Y-10飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的相對含量較出發菌少，且Y-10不飽和脂肪酸比例也比出發菌更低。Y-10細胞膜脂肪酸較低的不飽和度，影響了細胞膜的流動性，進而影響細胞膜物質運輸的功能。納他霉素作為胞外代謝產物，Y-10納他霉素產量較低可能是受到細胞膜流動性的影響。

3 結論

本試驗通過對納他霉素原始生產菌Streptomyces gilvosporeus TUST01采用ARTP誘變處理，并采用低pH值平板篩選結合24孔深孔板篩選獲得耐酸菌株Y-10。Y-10在pH4.0平板上生長良好且在不同的搖瓶發酵條件下，納他霉素產量和生物量都有明顯提高，說明Y-10具有較好的耐酸能力。在不控制pH值和控制pH6.3的正常5 L發酵罐條件下，Y-10都表現出較高的生物量，但納他霉素產量偏低。較高的生物量同樣證明了Y-10具有較好的耐酸能力。對Y-10的耐酸機制進行研究，通過比較Y-10與出發菌的胞內ATP水平發現，Y-10較出發菌株有更高的胞內ATP水平，保證了其在酸性條件下的正常生長。而通過氣相色譜-質譜技術研究發現Y-10細胞膜脂肪酸的不飽和度更低，可能影響了Y-10的納他霉素發酵生產。本文對耐酸菌株篩選及耐酸機制的部分研究可為進一步優化耐酸菌株篩選方法及揭示耐酸機制提供一定的參考。