苦參堿減輕百草枯誘導的模型小鼠肺纖維化

李美崎，鄧 俊，王宋平

(西南醫科大學附屬醫院 呼吸與危重癥醫學科， 四川 瀘州 646000)

百草枯(paraquat,PQ)是一種非選擇性除草劑，對人體具有極強的毒性，進入人體后，可引起多器官損傷，尤其是其可導致肺纖維化，病死率極高[1]。研究報道上皮細胞間充質轉化(epithelial-mesen-chymal transition，EMT)的異常激活在肺纖維化過程中起重要作用，促進膠原纖維的分泌和細胞外基質的沉積，最終導致肺纖維化[2]。苦參堿(matrine)是一種天然的生物堿，提取于傳統中草藥苦參，具有多種生物活性，對呼吸系統具有平喘、抗急性肺損傷、抗纖維化作用等[3]。雖然有研究報道稱，苦參堿能夠發揮抗纖維化作用，但苦參堿對百草枯所致肺纖維化是否也具有保護作用及其可能的作用機制尚不清楚，還有待進一步研究。因此，本研究通過腹腔注射百草枯以誘導小鼠肺纖維化模型，探討苦參堿對百草枯誘導的模型小鼠肺纖維化的保護作用及其可能的作用機制，為其在臨床中運用提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物：SPF級雌性BALB/C小鼠24只，6周齡，體質量17～19 g[湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,許可證號：SCXK(湘)2019-0004]，在溫度為23 ℃，濕度為40%～65%，12 h晝夜交替的封閉室內條件下適應性喂養2周，可自由進食及飲水。

1.1.2 主要試劑：百草枯(北京百靈威科技有限公司)；苦參堿(上海麥克林生化科技有限公司，純度：98%)；羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)試劑盒(南京建成科技有限公司)；BSA(牛血清白蛋白)(Roche生物科技公司)；BCA蛋白質濃度測定試劑盒、一抗稀釋液、二抗稀釋液(ASPEN科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠隨機分為對照組(control)、百草枯(PQ)組和苦參堿(matrine)組，每組8只。一次性腹腔注射百草枯(18 mg/kg)以誘導肺纖維化并建立模型。建立模型24 h后，matrine組每天予以苦參堿(100 mg/kg)灌胃進行干預治療，持續27 d。

1.2.2 HE染色觀察肺組織病理改變：將整個右肺組織用0.9%氯化鈉溶液充分沖洗，4%多聚甲醛室溫固定24 h以上，經75%無水乙醇梯度脫水，石蠟包埋，室溫冷卻后制成4 μm厚度切片，進行HE染色，在光鏡下觀察并拍照分析。

1.2.3 Masson染色及Ashcroft評分觀察肺組織膠原沉積：將肺組織進行固定、脫水、石蠟包埋、切片，進行Masson染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織膠原沉積情況，并拍照分析。參照文獻[4]，采用Ashcroft評分以評估肺組織纖維化程度，評分標準為：0級，正常肺組織；1級，肺泡或細支氣管壁微小纖維增厚；2～3級，肺泡壁中度增厚，肺組織結構無明顯損害；4～5級，纖維化加重，肺結構明顯受損，形成纖維帶或小纖維團塊；6～7級，肺組織結構嚴重破壞，纖維面積大，可伴有蜂窩肺形成；8級，滿視野纖維組織，整個肺組織全部閉塞壞死。

1.2.4 羥脯氨酸含量的檢測：稱取30 mg小鼠左肺肺組織，碾碎置于試管中，加入1 mL水解液并混勻，沸水浴充分水解20 min，NaOH調pH值至6.0～6.8左右，加入雙蒸水至10 mL，加入適量活性炭，混勻離心，取1 mL上清于波長550 nm處，1 cm光徑，測定各管吸光度值，并計算肺組織羥脯氨酸含量。

1.2.5 Western blot檢測膠原蛋白含量：提取肺組織總蛋白，使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量，電泳分離，將分離的蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上，封閉液室溫封閉1 h,加入一抗稀釋液(collagen Ⅰ、collagen Ⅲ，1∶500)4 ℃孵育過夜，通過TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，加入山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育30 min，采用化學發光劑(ECL)顯影，并分析目標帶吸光度值。

1.2.6 免疫熒光檢測EMT相關蛋白表達：取包埋好的石蠟切片，放入5%牛血清白蛋白(BSA)中封閉20 min。封閉后分別加入一抗(鼠抗 anti-α-SMA，1∶500，鼠抗 anti-E-cardherin，1∶1 000，鼠抗 anti-vimentin,1∶200)4 ℃孵育過夜,充分洗滌后，加入相應種屬比例的二抗(1∶50)，37 ℃孵育50 min,再用PBS洗滌3次，最后DAPI避光復染細胞核5 min，封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般情況

對照組小鼠精神狀態良好，進食、飲水正常，體質量穩定增加；PQ組小鼠精神萎靡，呼吸急促，活動減少，易抓捕，進食、飲水減少，體質量下降；matrine組小鼠較模型組小鼠癥狀有所改善。

2.2 HE染色

對照組小鼠肺組織結構正常，未見明顯形態學改變；PQ組小鼠肺組織結構明顯破壞，部分肺泡塌陷，大量炎性細胞浸潤；而matrine組小鼠肺組織炎性細胞浸潤及肺組織結構破壞程度較模型組小鼠有所減輕(圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織結構對比(HE染色)Fig 1 Comparison of lung tissue of mice in each group(HE staining,×400)

2.3 Masson染色

對照組小鼠未見明顯膠原沉積現象；PQ組小鼠肺泡形態改變，可見藍色膠原纖維沉積，而matrine組小鼠肺組織也可見膠原纖維沉積，但較PQ組得到改善(圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織對比(Masson染色)Fig 2 Comparison of lung tissue of mice in each group(Masson staining,×400)

2.4 Ashcroft評分

與對照組比較，PQ組小鼠Ashcroft評分明顯升高(P<0.001)，與PQ組比較，經matrine治療后，Ashcroft評分有所下降(P<0.001)(表1)。

表1 各組小鼠肺組織Ashcroft評分比較

2.5 羥脯氨酸含量的比較

與對照組比較，PQ組肺組織羥脯氨酸含量增高(P<0.001)，與PQ組小鼠比較，matrine治療后可降低肺組織羥脯氨酸的含量(P<0.001)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group圖3 各組小鼠羥脯氨酸含量對比Fig 3 Comparison of hydroxyproline content in lung tissue of each

2.6 肺組織纖維膠原蛋白相關蛋白表達的比較

與對照組小鼠肺組織中collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表達比較，PQ組肺組織中collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表達升高(P<0.001)；而matrine組小鼠肺組織中collagenⅠ、collagenⅢ蛋白表達較PQ組有所降低(P<0.001)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group圖4 Western blot檢測各組小鼠肺組織collagenⅠ、collagen Ⅲ蛋白表達

2.7 肺組織EMT相關蛋白表達的比較

與對照組比較，PQ造模后小鼠肺組織中上皮性鈣黏附蛋白(E-cardherin)含量降低(P<0.001)，而α-平滑肌蛋白(α-SAM)和波形蛋白(vimentin)含量升高(P<0.001)，matrine組小鼠與PQ組相比，E-cardherin蛋白含量升高(P<0.001)，而α-SAM和vimentin蛋白含量降低(P<0.05，P<0.001)(圖5)。

Blue represented the nucleus and red was the target protein：E-cardherin, α-SMA and vimentin proteins(×400); *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with PQ group

3 討論

百草枯(PQ)是一種速效、非選擇性的除草劑，因其具有價格低廉、低污染等特點，而廣泛應用于多數發展中國家[5]。其可通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑進入人體，對人體具有極大的毒性，高劑量的PQ可導致包括心、肺、腎、肝和腦在內的多個器官衰竭[6]。有研究報道，當PQ進入人體后，肺由于其強大的多胺攝取系統而成為主要的蓄積點，其肺濃度比血漿濃度高6～10倍，因此，肺是PQ病理作用的一個特定靶點[7]。PQ進入人體后，在肺泡上皮細胞中積累，導致肺組織損傷，早期可表現為肺泡充血、水腫、肺泡壁結構破壞以及各種炎性細胞的浸潤和滲出，進一步發展為成纖維細胞增生和過度膠原沉積，最后進展為肺纖維化[8]。百草枯中毒所致的肺纖維化目前尚無有效治療方法，臨床上主要使用糖皮質激素、 免疫抑制劑、 抗氧化治療等， 但治療效果不佳，病死率極高[9]。因此開發有效的藥物治療肺纖維化是必要的。

苦參堿是中草藥苦參中含量最高的生物堿，具有廣泛的生物作用，據報道，苦參堿對人類上皮細胞相關疾病具有潛在的治療功效[10]，已有相關研究報道，苦參堿能夠通過抑制JAK-STAT信號傳導途徑發揮抗博來霉素所誘導的肺纖維化作用[11]。而博來霉素和百草枯所誘導的肺纖維化在表型上相似，但兩者基因調控方式及數量是不同的[12]。那么，苦參堿是否可以減輕百草枯所誘導的肺纖維化，還有待進一步研究。

肺纖維化的主要特征是正常肺組織結構的破壞、成纖維細胞的活化及細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的沉積[13]。在肺纖維化中，細胞外基質的主要成分為I型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白，羥脯氨酸是一種非蛋白原性、非必需的氨基酸，是膠原蛋白的主要成分，對膠原蛋白的合成和穩定起著關鍵作用，因此，羥脯氨酸是反映膠原沉積程度的重要標志物[14]。本實驗發現與對照組比較，模型組的羥脯氨酸、膠原蛋白Ⅰ及膠原蛋白Ⅲ含量明顯升高，而予以苦參堿干預后，上述指標含量有所下降，病理學觀察發現肺纖維化程度有所減輕。說明，苦參堿可降低百草枯誘導的肺纖維化小鼠肺組織膠原蛋白的合成與積累。

研究表明，EMT是纖維細胞最重要的來源之一，Ⅱ型肺泡上皮細胞通過EMT獲得成纖維細胞表型后，產生大量的細胞外基質，促進肺纖維化的發展[15]。EMT的典型特征是極性喪失、細胞骨架重組、上皮形態和標志物(包括E-cadherin和occludens-1)的喪失，以及間充質形態和標志物(如α-SMA、vimentin)的獲得[16]。本研究發現經苦參堿治療后，小鼠纖維化肺組織中E-cadherin蛋白的表達有所增加，而α-SMA和vimentin蛋白的表達有所降低，抑制EMT作用，從而減少細胞外基質的沉積。

綜上所述，苦參堿可通過抑制EMT作用，從而抑制膠原蛋白的合成和積累，減輕百草枯誘導的肺纖維化作用。本研究為臨床應用苦參堿治療百草枯中毒所致肺纖維化提供了新的參考依據。