加味丹梔逍遙散對抑郁模型大鼠行為學(xué)及中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響*

劉曉敏，唐 彬，伊麗娥，馬端鑫，林亞明

(1.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500)

抑郁障礙是最常見的精神障礙之一，該病嚴(yán)重危害人類健康。根據(jù)WHO全球疾病負(fù)擔(dān)的研究，抑郁障礙占非感染性疾病所致失能的比重為10%[1]。以情緒低落、興趣缺乏以及樂趣喪失為核心癥狀[2]。目前研究認(rèn)為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)其濃度降低可導(dǎo)致情緒抑郁、行為絕望、精神不振等臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致抑郁障礙，而調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)濃度能有效緩解癥狀[3]，減輕抑郁障礙的癥狀[4]。筆者在前期的臨床研究中[5-6]，加味丹梔逍遙散臨床療效確切，為進(jìn)一步研究加味丹梔逍遙散的藥理機(jī)制。本次研究加味丹梔逍遙散對下丘腦、垂體單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 立柱體敞箱，離心機(jī)：離心機(jī)(國產(chǎn)湘儀CTK150R)，美國產(chǎn)EPOCH酶標(biāo)儀，國產(chǎn)新芝(GH-30)恒溫箱。

1.1.2 藥品與試劑 鹽酸氟西汀膠囊(規(guī)格：20 mg)禮來蘇州制藥有限公司提供(批號：9824A)；加味丹梔逍遙散為云南省名中醫(yī)林亞明教授經(jīng)驗方(方藥組成由丹皮，梔子，黃連，柴胡，川芎，白芍，當(dāng)歸，茯神，炙甘草，茯苓，白術(shù)，干姜，薄荷，香附，佛手，合歡皮，夜交藤適量組成(云南省中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供)；大鼠DA ELISA 試劑盒(批號：MB-1896B)、大鼠NE ELISA試劑盒(批號：MB-2097B)、大鼠5-HT ELISA 試劑盒(批號：MB-1983B)，由江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司提供。

1.1.3 動物 健康SD大鼠50只，♂，SPF 級，體重180～200 g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SYXK(滇)K2013-007]。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后進(jìn)行實驗。飼養(yǎng)條件為室溫為(22±1)℃、相對濕度為65%～70%、光照周期為12 h/12 h。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與給藥 將實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、加味丹梔逍遙散組、氟西汀組，在同樣的環(huán)境中飼養(yǎng)；每組各10只。

1.2.2 抑郁大鼠模型的制備 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除空白組外，其他各組大鼠每天給予1種應(yīng)激因子刺激，以構(gòu)建抑郁癥模型。應(yīng)激因子包括：傾斜鼠籠、禁食、潮濕墊料、限制行動、晝夜顛倒、禁水、強(qiáng)迫游泳、搖晃鼠籠、夾尾。

1.2.3 給藥 空白對照組： 不給予任何刺激，每日正常進(jìn)水、進(jìn)食，與模型組同一時間灌注生理鹽水。每日1次，連續(xù)21 d。模型組：每天灌注給藥容積為1 mL/100 g的等量生理鹽水，30 min后隨機(jī)給予一種應(yīng)激因子刺激。每日1次，連續(xù)21 d。加味丹梔逍遙散組：劑量換算，每天灌服加味丹梔逍遙散水煎液1.2 mL/100 g，30 min后隨機(jī)給予1種應(yīng)激因子刺激，每日1次，連續(xù)21 d。氟西汀組：每天灌服0.154 mg/mL的氟西汀懸浮液(1 mL/100 g)，30 min后隨機(jī)接受一種的應(yīng)激因子，持續(xù)21 d。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 觀察各組大鼠的一般狀態(tài) 于造模第1 d及第21 d分別對實驗動物進(jìn)行一般狀態(tài)監(jiān)測，包括精神狀態(tài)、進(jìn)食、體重等。

1.2.4.2 曠場實驗(Open-field test) 于實驗開始前1 d和第22 d各進(jìn)行一次曠場實驗。安靜環(huán)境下，將大鼠置于曠場箱中，箱體墻壁、底面劃分成面積相等的25塊方格。觀察3 min內(nèi)大鼠活動，以動物穿越底面塊數(shù)為水平活動得分，以直立次數(shù)為垂直活動得分。

1.2.4.3 大鼠懸尾實驗 實驗開始前1 d和第22 d各進(jìn)行一次大鼠懸尾實驗，將大鼠呈倒掛狀態(tài)，尾端(1 cm)固定于水平木板上，懸掛物兩側(cè)使用木板遮擋動物視線。實驗中，大鼠為克服不適體位而掙扎活動，一定時間后，大鼠可出現(xiàn)間斷性“不動”，顯示處于“失望”狀態(tài)，計算大鼠不動的時間(MT)，并觀察大鼠掙扎幅度。

1.2.4.4 糖水消耗試驗 在安靜房間內(nèi)，先訓(xùn)練大鼠適應(yīng)含糖飲水，先將大鼠飲用1%濃度的蔗糖水，每籠放置2個水瓶，在第一個24 h里，兩瓶均裝1%蔗糖水。在隨后的頭24 h，一瓶裝1%蔗糖水，另一瓶裝純水。適應(yīng)性訓(xùn)練完成后，禁水?dāng)嗍?4 h后，再進(jìn)行大鼠的基礎(chǔ)糖水/純水消耗試驗，給予每只大鼠等量的1瓶l%蔗糖水以及1瓶純水。60 min后，取兩瓶水定量測定計算大鼠的糖水偏愛百分比(糖水偏愛%=糖水消耗量/總液體消耗量×100%)。于實驗開始前開始前1 d、第22 d進(jìn)行一次糖水消耗試驗。

1.2.5 取材 實驗結(jié)束后，大鼠立即快速斷頭處死，在冰盤上迅速分離大鼠大腦，分離出下丘腦和垂體組織，稱重后置EpPendorf管中，保存于-80℃待測。

1.2.6 指標(biāo)檢測 取組織100 mg放入組織研磨器加入，制成勻漿。凍融2次，將組織勻漿，離心5分鐘取上清。取適量上清液用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定。吸光度(OD值)，計算樣本濃度。用樣本稀釋液將樣本1∶400倍稀釋。從試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，于6000～10000 rpm離心30 s。用1 mL樣本稀釋液溶解，充分混勻得到標(biāo)準(zhǔn)品，放置備用。樣本用樣本稀釋液進(jìn)行1∶400倍稀釋后根據(jù)試劑說明書操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得樣本的實際濃度。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，不同組差異采用多因素方差分析法比較，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠體重變化觀察結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠體體重測定結(jié)果

2.2 糖水消耗試驗 見表2。

表2 大鼠糖水?dāng)z入變化比較

2.3 曠場實驗 見表3。

表3 各組大鼠曠場變化比較

2.4 鼠尾懸掛實驗 見表4。

表4 各組大鼠鼠尾懸掛實驗比較

2.5 對下丘腦DA、5-HT、NE含量的影響 見表5。

表5 各組大鼠下丘腦DA、5-HT、NE含量測定結(jié)果

2.6 對垂體DA、5-HT、NE含量的影響 見表6。

表6 各組大鼠垂體DA、5-HT、NE含量測定結(jié)果

3 討論

中醫(yī)學(xué)并無“抑郁障礙”、“焦慮狀態(tài)”病名，依據(jù)其臨床癥狀表現(xiàn)特點(diǎn)，應(yīng)屬中醫(yī)“郁病”范疇，中醫(yī)認(rèn)為郁病是多因情志不暢、精神刺激致使憂思?xì)饨Y(jié)，氣機(jī)不暢，久之化熱生火，擾動心神失常而產(chǎn)生的疾病。

有研究表明[7-8]，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)參與到抑郁障礙發(fā)病的病理生理過程之中。5-HT和DA均屬于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與到中樞神經(jīng)系統(tǒng)多項活動中，5-HT、DA等神經(jīng)遞質(zhì)濃度的變化與抑郁障礙的發(fā)病可能有關(guān)[9-10]。中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-HT功能低下是抑郁障礙發(fā)病重要的神經(jīng)生物學(xué)標(biāo)志，可出現(xiàn)情緒低落、食欲降低、睡眠障礙、運(yùn)動功能抑制等表現(xiàn)[11-12]。多巴胺(DA)與人的情緒、快感、運(yùn)動功能有關(guān)。其既是NE的前體，又是獨(dú)立的神經(jīng)遞質(zhì)。有研究[13]檢測了抑郁障礙患者腦脊液中DA的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其含量較健康人群減少。有臨床研究[14]認(rèn)為通過增加中樞DA的濃度，可有效緩解抑郁障礙的臨床癥狀，而減少腦內(nèi)DA的濃度，則可出現(xiàn)抑郁患病率和復(fù)發(fā)率升高。現(xiàn)在，阻斷5-HT、NE重吸收和代謝的藥物已被廣泛地用于治療抑郁障礙[15]。近年來新出現(xiàn)的治療抑郁障礙藥物，包括選擇性5-HT再攝取抑制劑以及5-HT和NE重吸收抑制劑等[16-17]，這些都基于影響單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的代謝而起到治療作用[18-19]。下丘腦是單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的主要來源，也是大腦情感反應(yīng)的高級中樞，為此選擇下丘腦作為本研究的對象。目前，選擇性5-HT再攝取抑制劑為臨床治療抑郁障礙的常用藥物，該類藥物的主要藥理作用是選擇性抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前膜5-HT的再攝取[20]，達(dá)到增加突觸間隙內(nèi)5-HT含量，實現(xiàn)抗抑郁的治療作用；鹽酸氟西汀是臨床上常用的5-HT再攝取抑制劑，故本次研究使用鹽酸氟西汀作為陽性對照藥物。

研究中，造模初期，實驗大鼠即出現(xiàn)打斗、撕咬、尖叫等情緒過激行為。隨著造模時間的推移，實驗動物糖水偏愛度顯著下降、自主活動明顯減少、活動量減少、攝食行為降低、及體重增長緩慢等行為學(xué)改變，曠場實驗中的水平運(yùn)動和垂直運(yùn)動可作為反應(yīng)動物對陌生環(huán)境的探究行為與好奇程度的指標(biāo)，得分越高，提示其自主活動能力越強(qiáng)。實驗中，抑郁模型組動物在水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動均有減少趨勢，以上表明，實驗動物出現(xiàn)攝食興趣消失，運(yùn)動能力下降，這與臨床抑郁障礙表現(xiàn)的快感缺乏、興趣喪失等癥狀相一致，提示模型復(fù)制成功。

經(jīng)藥物干預(yù)后，模型大鼠活動較前增加，食、水?dāng)z入量逐漸增加，反應(yīng)較前靈敏。偶有斗打、撕咬等行為，表明藥物治療具有療效。加味丹梔逍遙散組大鼠體重增加接近空白對照組模型大鼠的體重增長量，可認(rèn)為加味丹梔逍遙散對抑郁模型大鼠體重起干預(yù)調(diào)節(jié)作用。曠場實驗中，模型組大鼠的水平及垂直運(yùn)動減少，說明模型大鼠在心理上已經(jīng)處于絕望和行為退縮狀態(tài)，自主活動能力和探究欲望明顯降低。氟西汀和加味丹梔逍遙散可提高抑郁模型大鼠的曠場實驗運(yùn)動時長，說明加味丹梔逍遙散對應(yīng)激狀態(tài)的抑郁情緒具有預(yù)防或治療作用。經(jīng)治療后，與模型組比較，氟西汀與加味丹梔逍遙散均可提高大鼠中樞下丘腦及垂體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA的含量。推測加味丹梔逍遙散治療作用可能與影響下丘腦、垂體5-HT、DA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝有關(guān)。

綜上所述，加味丹梔逍遙散能提高大鼠中樞下丘腦及垂體中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA的含量，從而能增加大鼠的快感程度和興趣程度，而起到治療抑郁障礙(郁病)的作用。但其具體作用的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究揭示。