基于網絡藥理學方法探究天麻素抗阿爾茲海默癥的作用機制*

張 科

(天津醫科大學總醫院，天津 300052)

阿爾茲海默癥(alzheimer’s disease，AD)是一種發病隱匿的中樞神經系統退行性疾病，65歲以上的人群多發，確診后很難控制，且目前治療效果不佳[1-3]。隨著全球人口老齡化社會的到來，AD 的發病率及患病人數逐年增加，嚴重威脅老年人群的健康，給人們的生活和社會帶來沉重的負擔，已經成為亟待解決的一個世界難題[4-7]?，F代研究表明，AD的可能的主要病理特征有：β-淀粉樣蛋白斑塊(β-amyloid plaques，Aβ斑塊)、過度磷酸化Tau蛋白形成神經纖維纏結、乙酰膽堿遞質減少、炎癥反應、神經元丟失及淀粉樣血管病等[8]。但是AD發病機制復雜，與多種因素有關，目前確切原因尚不明確。研究表明，氧化應激損傷參與AD的發病過程，并在AD發病機制的眾多學說中，氧化應激學說與其他諸多假說之間存在間接或直接的聯系[9]。目前AD的治療藥物主要有M型膽堿能受體激動劑、膽堿酯酶抑制劑、抗氧化藥物、抑制β-淀粉樣蛋白沉積藥等[10-11]。由于這些藥物的治療效果仍不太理想，同時某些化學合成類藥物還會造成一定的不良反應[12]。因而進一步從中藥中探索新的AD治療藥物，是一個重要的研究趨勢[13]。

天麻素(gastrodin，GAS)，是從蘭科植物天麻的干燥根塊中提取的一種天然酚類物質，具有較好的鎮靜、安眠、抗炎、抗氧化自由基作用，對神經衰弱、失眠、頭痛有緩解作用[14]。研究表明，GAS通過抑制神經膠質細胞的活化，減少Aβ蛋白的沉積保護神經元，起到改善學習和記憶功能障礙的作用[15-17]。在AD防治方面具有重要的理論意義，但對于GAS的潛在靶點及作用機制仍然不明確。

近年來，基于網絡藥理學對中藥復方或者單體成分進行物質基礎、靶點、通路分析的研究成為熱點。該方法通過構建多層次網絡，從基因、分子和細胞層面闡釋藥物的作用機制。PharmMapper是一款通過整合DrugBank、BindingDB、Target Bank和PPTD數據庫對藥效團模型進行反向預測靶點的工具，它能快速預測藥物分子作用靶標[18]。本文擬采用該方法探究GAS防治AD的潛在靶點及作用機制，為其進一步的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 預測天麻素的作用靶點 在Pubchem數據庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索關鍵詞“Gastrodin”獲取天麻素(CAS號：62499-27-8)的化學結構式，保存為“SDF”格式文件。利用Chem3D 18.0進行MM2力場優化后保存為mol2格式文件并上傳至PhrmMapper平臺服務器，設定物種為人類，選取z’-scoer>0[19]進行靶點預測，得到結果作為天麻素的靶點。并使用Uniprot數據庫，將靶點蛋白名稱(Protein name)轉換標準基因名(Gene symbol)，得到天麻素的潛在靶點。

1.2 篩選天麻素抗AD的靶點 打開Genecards數據庫，以“Alzheimer’s Disease”為關鍵詞檢索，收集AD疾病靶點，以 Excel 格式導出，然后將1.1中潛在靶點的標準基因名與疾病靶點基因取交集，作為天麻素抗AD的候選靶點。

1.3 構建蛋白互作網絡及關鍵靶點的篩選 蛋白質互作網絡(protein-protein interaction networks，PPI)是由蛋白通過彼此之間的相互作用構成，來參與生物信號傳遞、基因表達調節、能量和物質代謝及細胞周期調控等生命過程的各個環節。系統分析蛋白在生物系統中的相互作用關系，對了解生物系統中蛋白質的工作原理，了解疾病等特殊生理狀態下生物信號和能量物質代謝的反應機制，以及了解蛋白之間的功能聯系都有重要意義[20]。應用STRING數據庫對1.2項的候選靶點基因進行分析，使用Cytoscape軟件將分析結果繪制成天麻素抗AD的PPI 網絡，并對網絡進行拓撲結構分析。使用Cytoscape軟件中的“Generate style from statistics”工具設置網絡節點的大小和顏色。節點的大小和顏色深淺代表Degree值的大小，邊的粗細反映了Combine Score的大小，從中篩選出Degree值排名靠前的靶點作為重要靶點。

1.4 功能注釋和KEGG通路富集分析 DAVID不僅是個生物數據庫，也是一款在線分析軟件?？梢杂脕碜龌虻牟町惙治?，系統的生物功能注釋信息，進行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和KEGG通路分析[21]。將候選靶點導入DAVID6.8數據庫，并限定物種為人，進行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導出數據，對生物過程(P<0.05)和信號通路(P<0.05)進行篩選，并進行繪圖。

2 結果

2.1 天麻素靶點的預測結果 經PhrmMapper平臺服務器對天麻素進行靶點預測，將所得靶點蛋白名稱轉換為標準基因名，刪除重復和無效靶點，共獲得有效靶點69個，詳見表1。

表1 天麻素靶點預測結果

2.2 成分靶點與疾病靶點的交集 Genecards數據庫檢索得到10972個AD相關靶點基因，使用在線韋恩圖工具獲得55個天麻素預測靶點與AD的共有基因，見圖1、圖2。具體為：NUDT9、CA12、GSTP1、CHEK1、PGR、MTAP、BCHE、TGFBR2、FCAR、CA1、CCNA2、RTN4R、CA2、BMP7、HSPA8、PYGL、QPCT、ANg，HK1、GALK1、DAPK1、F2、PPARg，AMD1、PAH、DHFR、MMP3、CTSK、PLK1、MMP8、ESR1、CSNK1G2、BAG1、RHEB、MIF、CRAT、AZGP1、ESR2、ADE4D、

圖1 交集基因的韋恩圖

ADPK1、ESRRg，GPI、SORD、LDHB、B3 gAT1、EPHB4、GSK3B、PLAU、HEXB、DPP4、CES1、CASP3、ATOX1、LCK、HMGCR。

2.3 PPI 網絡的分析 將共有基因導入STRING數據庫進行分析，結果以TSV格式導入Cytoscape(v 3.7.1)軟件進行分析和可視化處理，節點的大小和顏色的深淺表示節點的度(Degree)的變化。分析結果顯示：PPI網絡包含44個節點，92條邊，平均節點Degree值為3.35，見圖2；使用軟件中Network Analyzer選項中的Network Analysis模塊進行分析，結果網絡中Degree值排名前20的靶點包括ESR1、CASP3、HSPA8、CCNA2、LDHB、PLAU、DHFR、PGR、GSK3B、BMP7、PPARg，MMP3、CHEK1、GSTP1、GPI、BAG1、F2、SORD、CTSK、MMP8。其中ESR1(Degree=17)，CASP3(Degree=15)，HSPA8(Degree=7)，CCNA2(Degree=7)，LDHB(Degree=7)，PLAU(Degree=6)在網絡中具有較高的Degree值，網絡參數見表2。

圖2 潛在靶點與AD靶點蛋白互作網絡圖

表2 蛋白互作網絡參數

2.4 功能注釋分析和KEGG通路富集分析結果

2.4.1 GO富集分析結果 DAVID 6.8 數據庫得到天麻素與AD的交集基因GO功能富集分析的結果：GO條目79個(P<0.05)，包括46個生物過程(BP)，8個細胞組成(CC)，25個分子功能(MF)，主要涉及生物學功能與過程包括：肽基蘇氨酸磷酸化、肽基絲氨酸磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、激酶活性、碳酸鹽脫水酶活性、絲氨酸型內肽酶活性等，具體結果見圖3和表3。

表3 潛在靶點與AD靶點交集基因 GO 富集分析結果(P<0.05，BP、MF、CC的 PValue值前5注釋)

圖3 GO富集分析結果

2.4.2 KEGG通路富集分析結果 通路富集分析結果得到信號通路8條(P<0.05)，包括氨基糖和核苷酸糖代謝、氮代謝、AMPK信號通路、胰島素信號通路、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甲狀腺激素信號通路、細胞周期，富集結果見圖4和表4。

表4 潛在靶點與AD靶點交集基因 KEGG 通路富集分析結果(P<0.05)

圖4 KEGG富集分析的8條通路圖

3 討論

從蛋白互作網絡圖分析可知，雌激素受體(ESR1)，半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)，尿激酶型纖溶酶原激活因子(PLAU)在網絡中處于關鍵地位。研究發現，衰老過程中雌激素受體的活性、表達水平及分布變化會引起大腦中雌激素的變化，而AD病情發展的一個重要的危險因素就是腦源性雌激素的下降[23]。Aβ毒性假說是目前AD 致病機制中占主導地位的學說。淀粉樣前體蛋白APP由于基因突變，在β分泌酶作用下產生具有神經毒性的Aβ，當其含量升高后，細胞并不能將其代謝掉，在細胞中大量的積累形成Aβ纖維沉積。幾乎所有的AD 患者腦細胞中都會出現不同程度的Aβ纖維沉積。胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE)可以促進AD患者腦Aβ降解，在AD患者腦中IDE會隨年齡的增加而下降，而雌激素受體β的激活可以上調IDE的表達，從而減少Aβ的沉積。同時雌激素受體的激活可以抑制促凋亡蛋白Bim的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-w的含量，從而降低Aβ介導的神經元毒性損傷[24]。同時，選擇性雌激素受體激動劑通過激活神經元細胞內鈣離子快速內流，引起絲裂原活化蛋白激酶信號傳導和細胞外調節蛋白激酶的磷酸化，起到保護神經的作用[25]；Caspase-3通過剪切靠近胞漿側C末端720位的天冬氨酸產生C末端異常的Aβ蛋白，這些蛋白對細胞有毒性作用，可誘導細胞凋亡[26]。另外，當早老素蛋白PS1和PS2基因突變和蛋白質過度表達時，Caspase-3可以酶切上述蛋白產生異常的氨基酸C末端片斷，而這些片段可以促進APP水解產生更多Aβ，從而加速神經元的凋亡[27]。PLAU基因可以編碼產生尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)，該因子與特異受體相結合，催化生成具有降解神經毒性Aβ蛋白作用的纖溶酶。因此uPA及其受體與AD發病的關系越來越受到關注[28]；而HSPA8、CCNA2、LDHB 與AD的關系尚未見相關報道，或可成為潛在作用靶點。

KEGG通路富集分析共得到8條與AD相關的通路，分別是氨基糖和核苷酸糖代謝、氮代謝、AMPK信號通路、胰島素信號通路、淀粉和蔗糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甲狀腺激素信號通路、細胞周期，以上通路均與代謝相關。在AD患者中，功能失調的下丘腦導致能量穩態紊亂和隨之而來的代謝障礙。在改變的代謝途徑中，肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和病毒感染增加了患AD的風險。研究顯示，AD患者的神經退行性表現與腦能量代謝紊亂有關[29]。研究顯示，在AMPKα2敲除的神經元細胞中Aβ生成會增加。可能的機制是由于激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)后，調節APP生成進而減少Aβ的產生[30-31]。胰島素信號通路可以直接或間接地參與Aβ的清除過程。研究發現，人體出現胰島素抵抗時，升高的胰島素水平可以提高β分泌酶活性，從而加速APP剪切生成更多的Aβ蛋白。因此通過調節IDE的活性來抑制Aβ的生成[32]。

綜上，基于網絡藥理學方法對天麻素抗阿爾茲海默癥的潛在靶點進行了預測，并對潛在靶點進行了蛋白互作研究，以及通路富集分析。天麻素或可以作為治療AD的一個新的潛在化合物。同時本研究也具有一定的局限性，所得結論均建立于數據庫及網絡藥理學技術，缺乏相關實驗的驗證。后期將繼續從其化合物結構改造、藥效評價以及機制驗證等方向開展試驗，為其進一步深入研究提供思路和參考。