新疆維吾爾族尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-21高表達

王慧琴，趙 洋，吳衛東

(新疆維吾爾自治區人民醫院 科研教育中心， 新疆 烏魯木齊 830000)

銀屑病(psoriasis) 是一種慢性、復發性炎性系統性疾病,難以根治，常罹患終身[1-2]。其臨床表現為鱗屑性紅斑或斑塊分布，目前銀屑病的發病機制尚不明確，可能的發病誘因與遺傳、環境、精神心理等因素相關。新疆地區銀屑病高發，且因地域、種族、生活習慣的不同具有自身的特殊性：與代謝性疾病相關的銀屑病在本地區表現為易于復發，難于治療、累及關節損害患者增多。隨著表觀遺傳學的發展，研究發現在銀屑病的發生發展中微小RNA(microRNA)異常表達與疾病密切相關[1-3]。目前關于miR-21調控靶蛋白Bcl-2在尋常型銀屑病中的作用研究鮮有報道。本研究以 miR-21為切入點，探究其在健康人群與維吾爾族銀屑病患者皮損組織中的表達差異，以及靶蛋白Bcl-2的表達情況。進一步轉染HaCaT細胞探討miR-21對靶蛋白的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例選擇：選取2013年至2019年間在新疆維吾爾自治區人民醫院皮膚科確診的51例維吾爾族尋常型銀屑病患者為實驗組，其中男性26例，女性25例，年齡為8～70歲，平均年齡為(34.3±14.0)歲；對照組來自泌尿外科、整形外科等無皮膚疾病的患者，本研究中取其手術中切除的多余皮膚組織，共選擇維吾爾族29例，其中男性18例，女性11例，年齡為8～66歲，平均年齡為(24.3±27.4)歲。所有樣本均用于免疫組化檢測分析，其中對照組和實驗組各15例。納入標準：所有銀屑病患者均經組織病理檢測確診，具有典型皮損癥狀。排除標準：患者在3個月內使用過維A酸類藥物、糖皮質激素等；合并嚴重心臟、肝、腎等疾病者；合并其他免疫性及腫瘤性疾病者；停止光療及外用藥物治療>1個月以上；女性患者排除月經期、妊娠期及哺乳期。正常對照組均排除銀屑病家族史，且無遺傳性疾病史及自身免疫性疾病史。此次研究經新疆維吾爾自治區人民醫院倫理委員會批準(審批號：KY2020041048)，參與患者均自愿參加，且簽署知情同意書。

1.1.2 試劑：人永生化角質形成細胞系HaCaT(南京凱基生物公司)，核酸提取miRNeasy Mini kit、反轉錄miScript Ⅱ RT kit、實時熒光定量miScript SYBR? Green PCR kit 試劑盒(Qiagen公司)；Bcl-2單克隆抗體、鼠兔通用型二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；BCL抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測miR-21：取凍存組織樣本提取總RNA，按照說明書操作執行。提取的樣本總RNA濃度及純度使用Thermo超微量核酸蛋白測定儀進行測定。反轉錄合成cDNA反應體積為20 μL，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。應用試劑盒檢測miR-21表達，反應體系20 μL，反應條件：95 ℃ 15 min，1個循環；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40個循環。計算2-△△Ct。樣本重復3個復孔，基于相同條件下檢測miR-21和U6，miR-21引物序列5′-GTGCAG GGTCCGAGGT-3′。擴增結束后采用軟件進行數據分析。

1.2.2 免疫組化法檢測Bcl-2蛋白表達：石蠟切片使用二甲苯脫蠟及梯度乙醇進行脫水，用Envision二步法染色；PBS緩沖液沖洗；pH6.0的檸檬酸緩沖液修復15 min，PBS緩沖液沖洗；室溫下加入過量過氧化氫孵育10 min，在此期間使用蒸餾水沖洗，PBS浸洗；滴加一抗Bcl-2，稀釋濃度為1∶500，孵育，4 ℃冰箱貯藏過夜；滴加二抗，室溫孵育45 min，使用PBS緩沖液沖洗；DAB顯色30 s內終止；而蘇木精使用鹽酸分化，經過脫水透明后使用中性樹膠封片。結果判斷：Bcl-2蛋白的陽性顯色表現為表皮基底層細胞胞質中出現棕黃色或棕褐色顆粒。結果判定評分是由兩名高級職稱病理醫師進行獨立雙盲閱片得出。

1.2.3 Western blot檢測Bcl-2蛋白表達量：HaCaT細胞培養：含10%胎牛血清的DMEM培養液中添加100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，37 ℃、5% CO2下培養。miR-21 mimic和miR-21 inhibitor轉染時將細胞匯合度控制為40%～60%，轉染過程根據說明書執行。轉染48 h后收集細胞，RIPA裂解細胞，之后采用BCA法對蛋白濃度測定。SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本，轉印到PVDF膜上，用5%蛋白質干粉TBST封閉1 h，TBST洗膜3次，10 min∕次，一抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜如上述操作。二抗同樣如此。

1.3 統計學分析

應用SPSS21.0統計軟件進行分析，實時熒光定量PCR結果采用LSD法分析。計量資料使用t檢驗。計數資料采用χ2檢驗分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-qPCR檢測miR-21

miR-21在維吾爾族尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達水平高于對照組(P<0.05)。miR-21在維吾爾族尋常型銀屑病皮損旁組織中的表達要低于皮損組織(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control；#P<0.05 compared with para-lesion圖1 尋常型銀屑病皮損、皮損旁組織及正常皮膚中miR-21的表達水平Fig 1 Comparison of miR-21 expression levels in lesions, para-lesion of psoriasis vulgaris and normal skin

2.2 免疫組化結果

Bcl-2蛋白陽性表達定位于胞質，在尋常型銀屑病與對照組中均有陽性表達。其中對照組中表皮棘層細胞表達有27例，占陽性表達率93.10%(27/29)；在維吾爾族尋常性銀屑病組中有18例在表皮棘層細胞表達，陽性表達率為35.29%(18/51)。兩組數據經卡方檢驗分析，實驗組即銀屑病組陽性率明顯低于正常皮膚組織(P<0.001)(圖2，表1)。

2.3 Western blot結果

miR-21轉染HaCaT細胞后，其過表達可抑制Bcl-2蛋白表達，相反則升高(P<0.001)。與對照組細胞比較， miR-21抑制表達時Bcl-2蛋白表達升高(P<0.001)，過表達時Bcl-2蛋白表達降低(P<0.001)(圖3)。

A.Bcl-2 positive expression; B.Bcl-2 negative expression圖2 Bcl-2的免疫組織化學檢測結果Fig 2 Immunohistochemical results of Bcl-2(IHC×100)

表1 不同皮膚組織中Bcl-2蛋白的免疫組化檢測結果

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with miR-21 inhibitors圖3 miR-21對Bcl-2蛋白表達的影響Fig 3 Effect of miR-21 on Bcl-2 protein expression

3 討論

銀屑病俗稱牛皮癬，易復發，難以根治，主要特征為角質形成細胞異常增殖和趨化因子誘導炎性細胞浸潤表皮。目前研究認為銀屑病是在多基因遺傳背景下發生的免疫異常疾病，發病機制復雜[3-5]。銀屑病表皮角質異常增生，說明患者表皮角質形成細胞周期存在異常情況[4-6]。研究發現miRNA在調控皮膚病中具有重要的作用[2]，miR-21可能參與了細胞增殖、侵襲及凋亡等多種生物學過程[7-9]。本研究前期發現銀屑病皮損組織中miR-21表達異常[9]，那么與細胞凋亡密切相關的miR-21是否通過調控靶蛋白參與了尋常型銀屑病表皮角質異常增生的過程？因此本研究選擇miR-21為切入點，以維吾爾族尋常型銀屑病患者作為研究對象，通過進行實時熒光定量PCR來檢測皮損處miRNA表達；并對其調控的下游靶蛋白Bcl-2進行檢測。

實時熒光定量PCR檢測結果表明：miR-21在維吾爾族尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達比正常對照高，miR-21的過表達可能參與維吾爾族尋常型銀屑病的發病及進展過程。miR-21表達明顯上調與芯片篩選以及其他學者的研究結果[11-12]一致。miR-21的異常表達可能調控其靶蛋白共同作用參與了銀屑病的發病。本課題組通過生物信息學軟件預測Bcl-2為miR-21的靶蛋白，Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡的重要調節分子，在線粒體水平決定細胞是否進入凋亡程序，從而在凋亡通路中發揮了重要調節功能[10-12]。

Bcl-2蛋白是家族成員中的抗凋亡蛋白，蛋白C末端疏水區可與細胞器的膜相連；N端跨膜區在Bcl-2抑制細胞凋亡過程中有重要作用[11-12]。Bcl-2蛋白與激活的促凋亡蛋白作用后失去了對細胞凋亡的抑制作用，導致細胞凋亡的發生。本項目免疫組化實驗發現：正常皮膚Bcl-2蛋白的陽性表達比維吾爾族尋常型銀屑病患者的高，說明銀屑病患者皮損處的Bcl-2表達被抑制，通過改變細胞凋亡參與調控銀屑病的發生發展過程。銀屑病重要病理特征為角質形成細胞異常增殖，因此本研究選擇HaCaT細胞作為轉染對象，由此觀察角質形成細胞的變化過程。免疫印跡法檢測結果表明：miR-21過表達可減低Bcl-2蛋白表達，而miR-21抑制表達時則起到促進Bcl-2蛋白表達的作用。HaCaT細胞的變化過程提示其與在體研究結果一致，由此認為miR-21可能調控了Bcl-2蛋白，兩者共同作用調節細胞凋亡功能，最終導致使表皮角質增殖異常，從而加速病程進展。