液態(tài)有機(jī)肥部分替代化肥對(duì)設(shè)施番茄根區(qū)細(xì)菌群落的影響

夏秀波， 李濤， 曹守軍， 姚建剛， 王虹云， 張麗莉

（山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265500）

化肥能夠提供作物所需的氮、磷、鉀、鈣、鎂、硫、鐵、錳、銅、鋅、硼、鉬等礦質(zhì)元素，具有養(yǎng)分濃度高、肥效快的特點(diǎn)，極大地豐富了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中的養(yǎng)分供應(yīng)，提高土壤肥力，使作物增產(chǎn)55%～65%[1]。隨著化肥的使用，養(yǎng)分搭配不合理、施用方式粗放、施用過(guò)量等帶來(lái)了一系列問(wèn)題，如土壤板結(jié)、鹽漬化、有益微生物減少、作物產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降等[2]。施用有機(jī)肥有利于改善土壤理化性質(zhì)[3]，改良土壤微生物種群結(jié)構(gòu)[4-5]，提高土壤肥力及作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)[6-7]。但傳統(tǒng)固態(tài)有機(jī)肥的施用存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、效率低、肥效慢等特點(diǎn)。相比固態(tài)有機(jī)肥，液態(tài)有機(jī)肥具有施用便捷、肥效快速、效率高等優(yōu)點(diǎn)。目前，液態(tài)有機(jī)肥在大田作物上研究較多[8-11]，在蔬菜作物上較少[12]，主要集中在對(duì)土壤理化性質(zhì)、作物產(chǎn)量品質(zhì)以及光合特性等方面。相比化肥，液態(tài)有機(jī)肥養(yǎng)分種類(lèi)多，功能多樣，因而液態(tài)有機(jī)肥與化肥配施能夠提高肥料利用率，改善土壤，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育，提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)[13-14]。但液態(tài)有機(jī)肥對(duì)于土壤微環(huán)境影響的研究較少，尤其對(duì)土壤微生物菌落結(jié)構(gòu)影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將液態(tài)有機(jī)肥按不同比例部分替代化學(xué)沖施肥，研究不同處理下設(shè)施番茄根區(qū)細(xì)菌菌群的組成結(jié)構(gòu)、多樣性，以期為設(shè)施番茄生產(chǎn)中液態(tài)有機(jī)肥與化肥的合理配施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年7月—2020年3月在山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院日光溫室內(nèi)進(jìn)行。土壤類(lèi)型為壤土，pH 7.6，有機(jī)質(zhì)60.0 g·kg-1，水解氮430 mg·kg-1，有效磷318.1 mg·kg-1，速效鉀1 660 mg·kg-1。

1.1 試驗(yàn)材料

番茄品種為煙粉209，由山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，種植密度為42 450 棵·hm-2。化學(xué)沖施肥為康晶（N:11%；P:11%；K:35%），由荷蘭雅苒集團(tuán)出品；液態(tài)有機(jī)肥為新壯態(tài)植物生長(zhǎng)促進(jìn)液（腐植酸≥30 g·L-1，N+P2O5+K2O≥200 g·L-1），由山東民和公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)以全部采用化學(xué)沖施肥為對(duì)照（T_CK），然后設(shè)置3個(gè)處理，分別為處理1：液態(tài)有機(jī)肥替代20%化學(xué)沖施肥（T_R20）；處理2：液態(tài)有機(jī)肥替代30%化學(xué)沖施肥（T_R30）；處理3：液態(tài)有機(jī)肥替代40%化學(xué)沖施肥（T_R40）。每處理3個(gè)重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，小區(qū)面積3.9 m2。分別于9月6日、9月27日、10月11日、10月26日和11月22日進(jìn)行追肥，具體用量詳見(jiàn)表1。其他栽培措施按照常規(guī)管理進(jìn)行。

表1 不同處理的施肥量Table 1 Fertilization amount of different treatments

1.3 根區(qū)土取樣和樣品高通量測(cè)序

各處理均于拉秧前在番茄植株根區(qū)5—10 cm、土層深度10—15 cm 處，采用取土器分別取樣，每個(gè)處理3次重復(fù)。所有樣品在-20 ℃保存?zhèn)溆茫糜谔崛』蚪MDNA。高通量測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4 DNA 抽提和 PCR 擴(kuò)增

土壤微生物群落總DNA 抽提按照E.Z.N.A.?soil DNA ki（tOmega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；DNA 的提取質(zhì)量采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；DNA 濃度和純度采用NanoDrop 2000 測(cè)定。對(duì)16S rRNAV3～V4 可變區(qū)的 PCR 擴(kuò)增 引 物 采 用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）[8]。

1.5 Illumina Miseq 測(cè)序

使用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，具體步驟參照劉森等[15]的方法。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用fastp 軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控[16]，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接[17]，具體參照劉森等[15]的方法。采用UPARSE 軟件[18]依據(jù)97%的相似度對(duì)序列OTU（operational taxonomic unit）聚類(lèi)和剔除嵌合體[18-19]。利用RDP classifier 進(jìn)行序列的物種分類(lèi)注釋[20]，并設(shè)定70%閾值對(duì)Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（v138）進(jìn)行比對(duì)。

Alpha 多樣性常用指數(shù)采用mothur（version v.1.30.1）軟件，具體算法如下。

①Chao 指數(shù)：用chao1 算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)。

式中，Schao1為估計(jì)的 OTU 數(shù)；Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的 OTU 數(shù)；n1為只含有1條序列的 OTU 數(shù)目；n2為只含有兩條序列的OTU數(shù)目。

②Ace 指數(shù)：用來(lái)估計(jì)群落中OTU 數(shù)目的指數(shù)(SACE)。

式中，CACE是樣本覆蓋度的估計(jì)值是稀有物種的變異系數(shù)；ni為含有i條序列的OTU 數(shù)目；Srare為含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU 數(shù)目；Sabund為多于“abund”條序列的 OTU 數(shù)目；abund為“優(yōu)勢(shì)”O(jiān)TU的閾值，默認(rèn)為10。

③Simpson指數(shù)：用來(lái)估算樣本中細(xì)菌多樣性的指數(shù)(Dsimpson)。

其中，Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OTU 數(shù)目；ni為第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N為所有的序列數(shù)。

④Shannon指數(shù)：用來(lái)估算樣本中細(xì)菌多樣性的指數(shù)。Shannon值越大，群落多樣性越高。

式中，Sobs為實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目；ni為第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N為所有的序列數(shù)。

⑤Coverage：是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高。

式中，n1為只含有1條序列的OTU 數(shù)目；N為抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)4個(gè)處理土壤樣本的細(xì)菌進(jìn)行高通量測(cè)序分析，共獲得有效序列251 559 條，有效堿基數(shù)目105 152 207 bp，序列平均長(zhǎng)度為 418 bp。4個(gè)處理樣本的具體序列個(gè)數(shù)、堿基數(shù)、平均序列長(zhǎng)度、最短序列長(zhǎng)度、最長(zhǎng)序列長(zhǎng)度詳見(jiàn)表2。按照97% 相似度，共產(chǎn)生 1個(gè)域，1個(gè)界，37個(gè)門(mén)，104個(gè)綱，268個(gè)目，441個(gè)科，730個(gè)屬，1 401個(gè)種，3 747個(gè)OTU（operational taxonomic units）。

表2 樣本信息統(tǒng)計(jì)表Table 2 Sample information statistics chart

2.2 稀釋性曲線分析

由圖1 可知，隨著序列數(shù)量的增加，4個(gè)土壤樣本的Sobs 指數(shù)曲線最終呈現(xiàn)平緩，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量已經(jīng)很大，能夠反映出各個(gè)處理樣本中大部分的細(xì)菌多樣性信息，測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。

圖1 細(xì)菌的Sobs稀釋曲線Fig.1 Rarefaction Sobs curves of OTU numbers

2.3 多樣性分析

T_CK、T_R20、T_R30 和 T_R40 處理樣本細(xì)菌的覆蓋度分別為0.991 6、0.990 5、0.989 5和0.992 0，表明測(cè)序基本涵蓋了所有OTU，測(cè)序結(jié)果能夠反映樣本細(xì)菌的真實(shí)狀況。各處理樣本細(xì)菌的Alpha 多樣性指數(shù)如表3 所示。T_R30 處理樣本的Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)最高，分別為3 081.20 和3 064.07，其次為 T_CK 和 T_R40，T_R20 最低，處理間均存在顯著差異。T_CK 樣本的Shannon 指數(shù)最高，T_R30和T_R20次之，且處理間差異不顯著；T_R40 最低，顯著低于其余處理。T_R40 處理樣本的Simpson 指數(shù)最高，顯著高于其余處理；T_R30 次之；T_R20 和對(duì)照 T_CK 較低，顯著低于其余處理。各處理樣本的Sobs 指數(shù)表現(xiàn)為T(mén)_R30、T_CK＞T_R40＞T_R20。綜上所述，測(cè)序基本覆蓋了所有OTU，以T_R30 處理樣本細(xì)菌的豐富度和多樣性較高。

表3 樣本細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of Bacteria in samples

2.4 細(xì)菌群落組成相關(guān)分析

由圖2 可知，4個(gè)處理樣品中共有OTU 值為1 338，占各樣品總OTU 的比例分別為49.67%（T_CK）、54.81%（T_R20）、49.17%（T_R30）和52.59%（T_R40）。T_CK、T_R20、T_R30 和 T_R40處理樣品中獨(dú)有的OTU 值分別為118、140、129和263，占各樣品總OTU 的比例分別為4.38%、5.74%、4.74%和10.34%。由此表明，液態(tài)有機(jī)肥部分替代化肥顯著增加了細(xì)菌種類(lèi)。

圖2 細(xì)菌OUT分布水平上的Venn圖Fig.2 Venn map of the level of bacteria OTU distribution

2.5 細(xì)菌群落組成分析

2.5.1 基于門(mén)（phylum）水平 各處理樣本的細(xì)菌群落在門(mén)水平的分布如圖3所示，共獲得13個(gè)類(lèi)群。在對(duì)照樣本（T_CK）中，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、Patescibacteria、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）和匿桿菌門(mén)（Latescibacteria），共占95.81%。在T_R20樣本中，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、Patescibacteria和異常球菌-棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus），共占95.79%。在T_R30 樣本中，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、Patescibacteria、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、Rokubacteria和Latescibacteria（匿桿菌門(mén)），共占96.02%。在T_R40樣本中，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、Patescibacteria、浮 霉 菌 門(mén)（Planctomycetes）、Rokubacteria 和硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae），共占97.00%。

圖3 門(mén)水平各樣本中細(xì)菌群落組成Fig.3 Composition of bacterial community on Phylum level

2.5.2 基于屬（genus）水平 各處理樣本中細(xì)菌在屬水平上的分布如圖4 所示，共獲得42個(gè)屬。在對(duì)照樣本（T_CK）中，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為norank_c_subgroup_6、芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus）、norank_f_A4b、芽 單 胞 菌 屬 （norank_f_Gemmatimonadceae） 、norank_o_SBR1031和norank_o_Saccharimonadales，共 占 31.21%。 在T_R20 樣本中，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為芽孢桿菌屬（Bacillus)、norank_c_subgroup_6、norank_f_JG30 -KF-CM45、norank_o_Actinomarinales、norank_c_JG30-KF-CM66、Paenisporosarcina、norank_f_A4b、芽單胞菌 屬 （norank_f_Gemmatimonadceae） 、norank_o_SBR1031和norank_c_Gemmatimonadetes，共 占34.61%。在T_R30 樣本中，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為norank_c_subgroup_6、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（norank_f_A4b、Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、norank_c_JG30-KF-CM66、norank_c_Gemmatimonadetes和RB41，共占 32.63%。在T_R40 樣本中，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為芽單胞菌屬（norank_f_Gemmatimonadceae） 、芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、norank_f_A4 b、norank_c_subgroup_6和norank_f_TRA3-20，共占27.81%。

圖4 屬水平各樣品中細(xì)菌群落組成Fig.4 Composition of bacterial community on Genus level

2.6 樣本比較和物種差異分析

2.6.1 聚類(lèi)分析 采用距離矩陣進(jìn)行樣本層級(jí)聚類(lèi)分析，結(jié)果（圖5）表明，細(xì)菌群落按照樣本間的距離可以劃分為3個(gè)不同的類(lèi)群，T_CK 和T_R30樣本為1個(gè)類(lèi)群，T_R40 和T_R20 樣本分別為單獨(dú)的類(lèi)群。

圖5 不同樣本細(xì)菌群落OTU水平層級(jí)聚類(lèi)樹(shù)系圖Fig.5 Hierarchical clustering tree of bacteria on OTU level

2.6.2 主成分分析 通過(guò)基于歐氏距離的PCA分析，共提取出2個(gè)主成分，貢獻(xiàn)率分別為76.05%和20.48%。4個(gè)處理樣本細(xì)菌的群落組成差異如圖6 所示，T_CK、T_R20、T_R30、T_R40 處理樣本的細(xì)菌群落組成存在明顯差異。其中，T_CK 和T_R30 距離最近，且在1個(gè)區(qū)，說(shuō)明2個(gè)樣本細(xì)菌的菌落組成相似度較高；T_R20 和T_R40 樣本細(xì)菌的菌落組成差異較大。

圖6 細(xì)菌群落OTU水平主成分分析Fig.6 Principal component analysis of bacteria on OTU level

2.6.3 非度量多維度分析 對(duì)4個(gè)土壤樣本細(xì)菌群落進(jìn)行非度量多維尺度(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析，結(jié)果（圖7）顯示，Stress 值為0，表明數(shù)據(jù)有很好的代表性。不同處理樣本的細(xì)菌群落在NMDS1 維度和NMDS2 維度能夠很好地被區(qū)分開(kāi)，其中，T_CK 和T_R30 處理樣本在圖中距離較近，說(shuō)明二者樣本細(xì)菌菌落組成相似度高；其他樣本的細(xì)菌菌群之間存在明顯差異。

圖7 基于相似性＞97%的OTU 水平上細(xì)菌非度量多維度分析Fig.7 NMDS plot of bacteria on OTU level based on similarity ＞97%

2.7 共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析

在屬水平上，對(duì)4個(gè)土壤處理樣本細(xì)菌群落的共性與豐度進(jìn)行比較，結(jié)果（圖8）表明，僅T_CK和T_R30樣本細(xì)菌群落的共性較大，其余樣本間共性較少。

圖8 細(xì)菌群落在屬水平的網(wǎng)絡(luò)分析Fig.8 Network analysis of bacteria on Genus level

2.8 功能預(yù)測(cè)分析

利用PICRUSt軟件對(duì)土壤樣本細(xì)菌群落功能組成進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖9）表明，4個(gè)處理樣本細(xì)菌的主要COG功能組成相似，但各COG相對(duì)豐度存在差異。

圖9 細(xì)菌群落的COG功能分類(lèi)和相對(duì)豐度Fig.9 COG function classification and relative abundance of bacteria

3 討論

土壤生態(tài)系統(tǒng)存在著數(shù)量龐大的微生物種群，細(xì)菌和真菌是這個(gè)種群中重要的組成部分。它們參與土壤中物質(zhì)和能量循環(huán)，對(duì)于土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定、養(yǎng)分的利用、土傳病害的調(diào)控和土壤健康的保持具有重要意義[21-22]。

3.1 液態(tài)有機(jī)肥替代化學(xué)沖施肥對(duì)設(shè)施土壤細(xì)菌多樣性的影響

研究表明，人為向土壤中大量施入外源物質(zhì)不僅導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性發(fā)生變化，還導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落多樣性降低[23]。但也有研究認(rèn)為，土壤微生物通常具有比較穩(wěn)定的多樣性特征，短期土壤培肥對(duì)土壤微生物無(wú)顯著影響[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著液態(tài)有機(jī)肥替代化學(xué)沖施肥比例的增加，土壤微生物的Shannon 指數(shù)有所降低，但Simpson指數(shù)有所升高，說(shuō)明土壤微生物的多樣性雖然有所降低，但差異不顯著；而土壤微生物的Ace 指數(shù)和Chao 指數(shù)先升高后降低，表明土壤的細(xì)菌豐度先升高后降低，與前人研究結(jié)果相一致[3,25-26]；且液態(tài)有機(jī)肥不同比例替代化學(xué)沖施肥增加了土壤細(xì)菌的種類(lèi)，改變了菌落的豐富度、多樣性和組成。不同處理比較發(fā)現(xiàn)，液態(tài)有機(jī)肥替代化學(xué)沖施肥以30%比例時(shí)土壤細(xì)菌的豐富度、Ace和Chao指數(shù)均較高。

3.2 液態(tài)有機(jī)肥替代化學(xué)沖施肥對(duì)設(shè)施土壤細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的影響

本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法對(duì)不同處理樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著液態(tài)有機(jī)肥替代化學(xué)沖施肥比例的增加，各處理樣本的主要優(yōu)勢(shì)菌組成在門(mén)、屬水平上基本相似，但相對(duì)豐度存在一定差異。施用化學(xué)沖施肥時(shí)處理樣本中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）；隨著液體有機(jī)肥替代化學(xué)沖施肥比例的增加，設(shè)施土壤中優(yōu)勢(shì)菌在原有3 種細(xì)菌的基礎(chǔ)上增加了厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes），且豐度值發(fā)生了明顯的變化，與前人研究結(jié)果基本一致[27-29]。土壤細(xì)菌豐度值的變化可能是由于施入液態(tài)有機(jī)肥后，有機(jī)肥中的微生物菌群與土壤微生物群落間存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用。變形菌門(mén)（Proteobacteria）能夠促進(jìn)氮肥的利用，增強(qiáng)植物病蟲(chóng)害防治、土壤修復(fù)和復(fù)雜污染物降解等能力；綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）可利用3-羥基丙酸途徑固定CO2產(chǎn)生能量[30]；酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）能夠促進(jìn)動(dòng)植物體降解[31]；芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）的芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞桿菌屬（Pseudomonassp）具有抑制植物病原菌、促進(jìn)作物營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)的作用[32-33］。綜上所述，液態(tài)有機(jī)肥與化肥配施有利于提高肥料利用率、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、改善土壤微環(huán)境、保持土壤的可持續(xù)利用。但隨著液態(tài)有機(jī)肥部分替代化肥施用年限的增加，土壤微環(huán)境的變化及作用效果有待于進(jìn)一步研究。