HPLC 法測定不同產地柑橘第一次生理落果中活性成分的含量

李 陽，安 琪，宋 悅，屈沙沙，范 剛, ，任婧楠，潘思軼

（1.華中農業大學食品科學技術學院/環境食品學教育部重點實驗室，湖北武漢 430070；2.果蔬加工與品質調控湖北省重點實驗室（華中農業大學），湖北武漢 430070）

柑橘類水果是世界上消費最多的水果之一，其包括柑、橘、柚、橙、檸檬等多個品種，營養全面，栽培廣泛，深受消費者的喜愛。柑橘生理落果，又稱柑橘落果，是由于植物生理原因而凋落的，落果的高峰期集中在每年的五月到六月，分兩次進行。第一次落果時間短而集中，落果量大，約占總量的98%；第二次落果數量較少，果實較大。柑橘落果曬干后可作藥用，具有破氣消積，化痰除痞，理氣健脾等功效。有研究表明，未成熟落果的藥用作用比已成熟果實更強，且第一次生理落果中的有效活性物質含量高于第二次落果。

柑橘落果中含有多種營養成分，如類黃酮化合物（flavonoids）、檸檬苦素（limonin）、生物堿類物質等，黃酮類化合物按其結構可分為黃烷酮類（flavanone）、黃酮類以及多聚甲氧基黃酮類三大類。黃烷酮類主要包括橙皮苷（hesperidin）、柚皮苷（naringin）、蕓香柚皮苷（narirutin）、新橙皮苷（neohesperidin）等；黃酮類包括木犀草素（luteolin）、香葉木素（diosmetin）、槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）等；多聚甲氧基黃酮類化合物可以被看作柑橘分類的標識物，是柑橘屬植物中的特有成分。類黃酮化合物在柑橘落果活性物質中占據很大比例，具有抗癌、抗炎抑菌、抗增殖、神經保護以及降血糖等功效，被廣泛應用于食品科學、化學以及醫學領域，近年來越來越多地受到消費者的關注。檸檬苦素是柑橘果實中最常見的檸檬苦素類化合物之一，也是柑橘屬植物苦味的主要來源。目前已被人們發現的檸檬苦素類化合物大約有三百余種，根據其結構大致分為檸檬苦素苷元（limonin aglycones）、降解性檸檬苦素類似物（degraded limonoids）以及糖苷型檸檬苦素類似物（limonoid glucosides）三類，具有抗腫瘤、鎮靜、調節人體內膽固醇水平以及除蟲殺蟲等功效。辛弗林（synephrine）是存在于蕓香科柑橘屬植物枳實、枳殼、陳皮等多種中藥材中的一種生物堿，具有提高新陳代謝，增加熱量消耗，強心護心，調節血壓和調節胃腸平滑肌，促進胃腸運動等方面的作用。

柑橘落果率高，座果率低，每年雖產生大量落果，但僅有少數能得到利用，大多柑橘落果腐爛地中，不僅加重了環境負擔，且造成了嚴重的資源浪費。本研究從全國各柑橘主要產區湖北宜昌、湖南懷化、廣東潮州、廣西南寧、福建漳州、浙江衢州等地分別收集了柑、橙、柚三種柑橘屬植物的第一次生理落果，并選取其中具有代表性的六種有效活性成分（川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素、辛弗林）作為定量檢測指標，采用HPLC 法測定其含量，旨在選取有效活性成分含量豐富的柑橘落果品種，為將來從中進一步提取活性成分并將其應用到各方面奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本試驗選取柑橘屬植物中的柑、橙、柚作為研究對象，由于各產地氣候差異，柑橘第一次生理落果時間有所不同，故本實驗的原料采集日期自4 月底開始，至6 月初結束，分別從湖北宜昌、湖南懷化、廣東潮州、廣西南寧、福建漳州、浙江衢州等柑橘主要產區收集，具體品種見下表1；川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林對照品（HPLC 級）

表1 柑橘落果品種Table 1 Citrus young fruit cultivars

均購自上海源葉生物科技有限公司，HPLC≥98%；乙腈、甲醇 色譜純，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）色譜純，購自武漢市偉琪博星生物科技有限公司；磷酸 分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司。

Waters-e2695 高效液相色譜儀 美國沃特世公司；DHG-06-100B 電熱恒溫鼓風干燥箱 武漢海聲達儀器設備有限公司；MM400 冷凍混合球磨機Retsch 公司；YB-300 高速多功能粉碎機 永康市速鋒工貿有限公司；Milli-Q 超純水機 貝徠美生物科技有限公司；KQ-300DE 超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-D（III）循環水式多用真空泵上海力辰邦西儀器科技有限公司；JE203 電子天平上海浦春計量儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取橙皮苷、柚皮苷、川陳皮素、檸檬苦素、辛弗林對照品20 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶液，定容，搖勻，得各對照品儲備溶液。分別精密吸取1、3、5、7 mL 對照品儲備溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，即得各濃度對照品溶液。橘皮素：精密稱取橘皮素對照品20 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶液，定容，搖勻，得橘皮素對照品儲備溶液。分別精密吸取0.5、1、1.5、2、2.5 mL 橘皮素對照品儲備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到各濃度對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 將不同品種落果置于60 ℃烘箱烘干至恒重，用高速粉碎機打成粉末，過60 目篩，精確稱取1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質量，超聲處理30 min 后取出，放冷至室溫，稱定質量，補齊質量，搖勻過濾，取續濾液，過0.22 μm 濾膜，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Global Chromatography C柱，規格：250 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫：30 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量：10 μL。川陳皮素、橘皮素：流動相為超純水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，條件為0～15 min，40%～55% B；15～20 min，55%～70% B；20～30 min，70%～80% B；檢測波長為330 nm。橙皮苷、柚皮苷：流動相為超純水（A）-乙腈（B），等度洗脫，條件為80:20；檢測波長為283 nm。檸檬苦素：流動相為超純水（A）-乙腈（B），等度洗脫，條件為55:45；檢測波長為210 nm。辛弗林：流動相為超純水（A）-乙腈（B），等度洗脫，條件為68:32，水中含0.05%十二烷基磺酸鈉和0.02%磷酸；檢測波長為275 nm。

1.2.4 定性及定量方法 吸取最高濃度的各對照品溶液1 mL，用甲醇稀釋，分別定容至25 mL 容量瓶，放入紫外分光光度計中，在200～400 nm 波長范圍內掃描，根據紫外吸收圖譜中最大吸收波長對活性成分進行HPLC 法測定。隨后精密吸取各對照品溶液及供試品溶液10 μL，按“1.2.3”項色譜條件進行分析，每個樣品設置三個平行，使用外標法，根據所得各活性成分保留時間以及峰面積計算各供試品溶液中川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林的含量。

1.3 數據處理

利用Excel、SPSS Statistics 26 軟件對測定數據進行統計分析。每組樣品設置三個平行，結果以平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定 利用紫外可見分光光度計分別對川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林6 種物質溶液進行掃描，結果顯示川陳皮素與橘皮素兩種多甲氧基黃酮均在330 nm 附近有最大吸收波長；橙皮苷與柚皮苷均在283 nm 附近有最大吸收波長；檸檬苦素的最大吸收波長出現在210 nm 處，辛弗林的最大吸收波長為275 nm。故選擇上述波長條件進行高效液相色譜的檢測，如圖1 所示。

圖1 各活性成分紫外吸收光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of active components

2.1.2 流動相的確定 為獲得較好的分離度，結合出峰時間、峰型等因素，參考文獻報道[19-22]稍作調整。最終確定選擇乙腈-水作為流動相，取“1.2.2”項中的供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄譜圖如下。由圖2 可知，A 圖中的1、2 號峰分別為川陳皮素與橘皮素，兩種多甲氧基黃酮的色譜峰分離度及峰型均較好，符合高效液相色譜定量分析的一般要求；B 圖中的3 號峰為橙皮苷色譜峰，同一波長下沒有其余雜質峰，峰型較好；C 圖中的4 號峰為柚皮苷色譜峰，同一波長下沒有其余雜質峰，分離度好，峰型標準；D 圖中的5 號峰為檸檬苦素；E 圖中的6 號峰為辛弗林，可以看出峰與峰之間分離清晰，分離度均大于1.5，峰型標準，如圖2 所示。

圖2 柑橘落果供試品溶液HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the test solution of young Citrus fruit

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性關系、檢出限及定量限的考察 精密吸取“1.2.1”項下各濃度的對照品溶液10 μL 注入液相色譜儀，以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸分析；取各單品對照品溶液，用甲醇稀釋，分別以信噪比S/N=3 和S/N=10 時對應的物質濃度為檢出限（LOD）和定量限（LOQ），結果見表2。結果顯示，各成分在各自線性范圍內均呈良好的線性關系，決定系數均大于0.99，檢出限在0.05～0.12 μg/mL 范圍內，定量限在1.14～3.53 μg/mL 范圍內。

表2 線性回歸方程Table 2 Linear regression equation

2.2.2 精密度試驗 精密吸取“1.2.1”項中所配制的不同濃度各對照品儲備液中濃度最高溶液10 μL，在上述“1.2.3”的色譜條件下，連續進樣6 次，記錄川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素和辛弗林的峰面積，計算其峰面積的相對標準偏差RSD（n=6）。結果顯示各對照品溶液峰面積RSD 范圍為0.37%～0.79%，均≤2.0%，表明儀器具有較好的精密度。

2.2.3 穩定性試驗 取烘干粉碎后的同一品種落果樣品，按“1.2.2”項下方法制備供試液，分別在0、2、6、10、12、24 h 進樣，按照上述“1.2.3”項色譜條件測定川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林的峰面積，測定結果顯示以上物質的RSD（n=6）分別為0.56%、0.33%、0.67%、0.71%、0.48%和0.36%，表明供試品溶液在室溫下24 h 內穩定。

2.2.4 重復性試驗 取同一品種烘干粉碎后的落果樣品共6 份，每份1.0 g，精密稱定，按“1.2.2”項下方法制備供試液，分別測定川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素以及辛弗林的含量，計算得出它們的RSD（n=6）分別為1.44%、0.89%、0.59%、1.24%、1.17%和0.95%，表明該方法重現性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 選取浙江衢州胡柚和湖北宜昌臍橙兩品種落果進行加樣回收試驗，精密稱取已知含量的兩品種供試樣品共18 份，每份1.0 g，分別加入不同濃度的川陳皮素、橘皮素、橙皮苷、柚皮苷、檸檬苦素、辛弗林的對照品溶液適量，按供試品溶液的制備方法制備加樣供試液并按“1.2.3”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果表明：川陳皮素的平均回收率為97.5%（RSD=0.6%）、橘皮素的平均回收率為97.3%（RSD=1.1%）、橙皮苷的平均回收率為99.4%（RSD=1.2%）、柚皮苷的平均回收率為100.8%（RSD=0.8%）、檸檬苦素的平均回收率為99.5%（RSD=1.1%）、辛弗林的平均回收率為98.0%（RSD=1.4%），表明該方法準確可靠，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果Table 3 Test results of sample addition recovery

2.3 柑橘第一次生理落果中有效活性成分含量測定

對照品溶液與供試品溶液各進樣10 μL，每個樣品作三次平行，記錄峰面積。對于未在線性范圍濃度內的樣品進行稀釋或濃縮處理，測定結果見表4。

由表4 可知，不同產地間柑品種落果中川陳皮素含量由高到低前6 位依次為浙江衢州＞湖北宜昌＞廣東潮州＞云南麗江＞廣西南寧＞湖南懷化，與橘皮素和橙皮苷含量由高到低前6 位相同，只存在個別省份的順序差異。福建漳州、重慶與四川眉山三地落果中諸如多甲氧基黃酮、橙皮苷等黃酮類化合物的含量較少，由此可以推測，在我國東部、中東部以及南部地區所種植的柑類落果中含有的黃酮類化合物含量較高，西南部柑類落果中黃酮類化合物含量較少。檸檬苦素在柑類落果中含量由高到低前6 位為浙江衢州＞廣西南寧＞廣東潮州＞福建漳州＞湖北宜昌＞湖南懷化，均超過100 μg/g。辛弗林含量較高的柑品種主要集中在我國中東部以及南部的廣西、湖北等地。

表4 不同產地柑、橙、柚品種落果生理功能活性物質含量Table 4 Contents of physiological functions and active substances in young fruits of mandarin orange,orange and pomelo varieties from different habitats

各產地橙品種中川陳皮素與橘皮素含量變化差異不大，橙皮苷含量由高到低為湖北宜昌＞廣西南寧＞重慶＞浙江衢州＞云南麗江＞湖南懷化，檸檬苦素含量較高的產地集中在廣西南寧、湖北宜昌、江西贛南，含量超過100 μg/g，與譚潤雅等的測定結果一致。辛弗林含量由高到低前6 位為重慶＞福建漳州＞湖南懷化＞江西贛南＞云南麗江＞浙江衢州，推測在我國西南部以及東南部種植的橙品種落果中辛弗林的含量較高。

柚品種落果中含有豐富的柚皮苷，其中含量較高的品種主要集中在湖北宜昌、重慶、江西贛南以及福建漳州等地，含量均超過15000 μg/g。檸檬苦素含量較高的地區為福建漳州，廣西南寧以及湖北宜昌，均超過200 μg/g。柚皮苷和檸檬苦素是柑橘中起主要作用的苦味物質，由此可推測，在我國中部以及東南部地區種植的柚子品種落果中的苦味物質較多，東部及南部地區柚子落果中苦味物質相對較少。

3 討論與結論

本研究選取我國不同產地柑橘主要產區的柑橘第一次生理落果為試驗原料，采用HPLC 法進行測定，分析結果表明，不同產地不同品種柑橘落果中黃酮類化合物、檸檬苦素以及生物堿辛弗林的含量差異顯著。

從總體來看，在所檢測的所有柑橘屬植物中，川陳皮素含量最高的是浙江衢州的柑品種落果，為359.63 μg/g，其次為湖北宜昌、云南麗江以及廣東潮州的柑品種落果。柑品種中川陳皮素的含量明顯高于橙品種。橘皮素含量最高的同樣為浙江衢州的柑，為222.14 μg/g。其次為湖北宜昌、云南麗江以及湖南懷化的柑品種落果，柑品種中橘皮素的含量普遍大于橙品種。柚品種中僅能檢出少量的多甲氧基黃酮，與趙梓燕的檢測結果一致。由于胡柚為柚與柑雜交栽培出的雜交柚品種，故其中多甲氧基黃酮的含量略高。除浙江衢州胡柚以外，其他的柚類落果中川陳皮素、橘皮素含量均在10 μg/g 以下。

橙皮苷含量最高的落果品種為湖北宜昌橙，為1485.73 μg/g，其次為廣西南寧的橙品種、柑品種以及浙江衢州的柑品種落果。柑品種與橙品種中橙皮苷的含量大致相同，沒有明顯差異。除在浙江衢州胡柚中檢測到少量橙皮苷以外，其余柚品種落果均不含橙皮苷。湖北宜昌柚中的柚皮苷含量最高，為20.97 mg/g，其次為重慶、江西贛南以及福建漳州的柚品種落果。柑品種、橙品種落果中均未檢出柚皮苷。

福建漳州的柚落果中檸檬苦素含量最高，為866.73 μg/g。其次為廣西南寧柚、浙江衢州柑以及廣西南寧的柑品種落果。廣西南寧的沃柑落果中辛弗林含量最高，為1004.14 μg/g。其次為湖北宜昌椪柑，福建漳州沃柑以及湖南懷化椪柑。柚品種落果中均未檢出辛弗林，柑品種中辛弗林含量普遍高于橙品種。

與張靜等的研究成果對比發現，柑橘幼果中的川陳皮素、橘皮素兩類多甲氧基黃酮的含量顯著大于成熟柑橘果肉中的含量。柑品種落果中的川陳皮素含量與成熟柑橘果皮中含量近乎一致，柑、橙品種落果中的橘皮素含量與成熟柑橘果皮中含量近乎一致。橙皮苷的含量略小于成熟柑橘果肉中的含量；與蘇智先等的研究結果比較，柚類幼果中的柚皮苷含量普遍大于成熟柚果實中的柚皮苷含量，說明隨著柚類果實的成熟，苦味物質逐漸減少；與吳今人等的研究結果進行對比發現，柑、橙、柚類幼果中檸檬苦素的含量普遍小于成熟柑橘果肉與果皮；與劉偉等的研究結果進行比較，發現柑、橙幼果中的辛弗林含量均小于成熟柑橘中的辛弗林含量。

黃酮類化合物的常規檢測方法例如紫外分光光度法等，只能測定總黃酮的含量，且實驗中發現紫外吸收光譜測定的黃酮含量誤差較大，準確度不高，可靠性差。本實驗選用HPLC 法測定柑橘落果中的活性成分，既方便快捷，又具有較好的靈敏性、準確度，還可同時測定多種物質，能夠滿足不同產地不同品種柑橘落果的測定要求。

從質量評價角度來看，經過現代藥理學研究證實，黃酮類化合物如橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等具有保護心血管健康、抗疲勞焦慮等功效；生物堿類化合物辛弗林可促進胃腸動力，松弛支氣管平滑肌，與《中國藥典》2015 年版所記載中功效相一致。故可以橙皮苷、柚皮苷以及辛弗林的含量作為評價柑橘落果質量的標志物。結合實驗結果可以看出，湖北宜昌的柑品種、橙品種、柚品種，廣西南寧的橙品種、柑品種以及重慶的柚品種落果的質量較高，具有良好的藥理活性。從提取有效成分含量最大化的角度來看，在未來進行柑橘落果中生理活性物質的提取試驗時選擇浙江衢州、廣西南寧的柑品種，湖北宜昌的橙品種，福建漳州以及湖北宜昌的柚品種預計可獲得較高的有效成分含量，能夠顯著凸顯提取效果。

柑橘生理落果資源豐富，采用HPLC 法測定不同產地柑橘落果中活性成分的含量，有助于對落果的針對性利用，爭取資源利用最大化，具有極大的工業化生產價值，另外對于減輕環境負擔，減少污染等方面也具有重大的現實意義。本實驗僅探究了不同產地柑橘落果中活性成分含量的區別，至于造成以上差異的原因例如環境土壤、種植方式、氣候條件等外部因素還有待進一步研究。