3 類辣椒對(duì)鲊廣椒細(xì)菌類群和品質(zhì)的影響

席 啦，熊英梅，王玉榮，侯強(qiáng)川，王 婷，楊 瑩，郭 壯,

（1.湖北文理學(xué)院湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北襄陽(yáng) 441053；2.湖北文理學(xué)院乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北襄陽(yáng) 441053；3.襄陽(yáng)市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北襄陽(yáng) 441001）

鲊廣椒通常以辣椒和玉米或大米為主要原料，以食鹽和香辛料為輔料，于倒扣陶瓷罐中密封發(fā)酵30 d 以上制作而成，在我國(guó)湖北省、湖南省、貴州省、四川省、陜西省和重慶市的部分地區(qū)具有較為廣泛的食用人群。因采用厭氧發(fā)酵，鲊廣椒口感酸爽且富含乳酸菌，其中乳酸桿菌（）的含量可以占到細(xì)菌總量的70%以上。我國(guó)華中和西南地區(qū)人群具有“嗜辣”的飲食特點(diǎn)，作為鲊廣椒的“靈魂”，辣椒對(duì)鲊廣椒品質(zhì)的形成起到了重要作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，辣椒表面附著的微生物種類可能對(duì)鲊廣椒發(fā)酵體系中微生物類群產(chǎn)生重要影響，例如若辣椒出現(xiàn)了腐敗的情況則鲊廣椒中青枯菌屬（）的含量就會(huì)明顯偏高。我國(guó)辣椒品種繁多，不同品種的辣椒辣度存在較大的差異，如小米椒（Linn.）、二荊條辣椒（L.）和菜椒（L.var（L.）Sendt.）的辣度分別在30000～50000 SHU、5000～15000 SHU 和500～1000 SHU，且辣椒自身含有的辣椒素等物質(zhì)具有抑菌作用，可能對(duì)鲊廣椒發(fā)酵體系中部分微生物菌株起到抑制作用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)揭示微生物群落結(jié)構(gòu)與發(fā)酵食品品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，對(duì)發(fā)酵食品中關(guān)鍵微生物類群進(jìn)行了甄別，證明了通過(guò)影響發(fā)酵體系的菌群結(jié)構(gòu)，制作工藝、原材料和制作環(huán)境等因素均會(huì)對(duì)發(fā)酵食品的品質(zhì)產(chǎn)生影響。本團(tuán)隊(duì)前期研究亦表明鲊廣椒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和產(chǎn)品品質(zhì)均受到地域、大米和玉米添加比例及是否添加外源乳酸菌菌株等多方面因素的影響，而關(guān)于辣椒種類是否會(huì)對(duì)鲊廣椒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其品質(zhì)產(chǎn)生影響的研究報(bào)道尚少。

滋味和風(fēng)味作為食物品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，其相對(duì)強(qiáng)度的大小直接影響著食品品質(zhì)的好壞。質(zhì)譜類技術(shù)的迅速發(fā)展為解析食物中的組分提供了有效的手段，其能對(duì)食物中各種標(biāo)志物進(jìn)行甄別，但由于樣品的前處理和分析過(guò)程較為復(fù)雜、一次甄別的標(biāo)志物過(guò)多和不同化合物之間的相互影響，其并不能準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)食品的整體品質(zhì)；而電子舌和電子鼻作為一種新出現(xiàn)的仿生技術(shù)，其對(duì)樣品的滋味和風(fēng)味具有整體選擇性，不僅解決了各類呈味物質(zhì)相互作用的問(wèn)題，還排除了人為因素和實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)的影響，在食品品質(zhì)的評(píng)價(jià)上具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

本研究以小米椒、二荊條和菜椒等3 種辣度不同的辣椒為試驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)置不添加任何蔬菜和只添加芹菜（var.）的2 個(gè)對(duì)照組，以玉米為主要原料，通過(guò)自然發(fā)酵分別進(jìn)行了鲊廣椒的制備。在使用電子舌和電子鼻對(duì)鲊廣椒品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用MiSeq 測(cè)序技術(shù)對(duì)鲊廣椒中細(xì)菌類群進(jìn)行了解析，采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)鲊廣椒的優(yōu)勢(shì)菌屬和品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行了揭示，以期為鲊廣椒這一特色發(fā)酵食品的產(chǎn)業(yè)化推動(dòng)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白胡椒 上海味好美食品有限公司；花椒 滕州滋正食品有限公司；食鹽 江蘇井神鹽化股份有限公司；玉米糝、小米椒、二荊條辣椒、菜椒和芹菜市售；引物338F/806R 武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成；FastPfu Fly DNA 聚合酶、dNTPs Mix 和10×PCR buffer 北京全式金生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因組提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN 公司；氯化鈉（分析純）天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；陰陽(yáng)離子溶液、味覺(jué)標(biāo)準(zhǔn)液和參比溶液 日本INSENT 公司。

LC-LX-HRF250E 高速冷凍離心機(jī) 上海力辰儀器科技有限公司；SA 402B 電子舌 日本Insent 公司；PEN3 電子鼻 德國(guó)Airsense 公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina 公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國(guó)Protein Simple 公司；ND-2000C 微量紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Nano Drop 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鲊廣椒樣本的制備 分別稱取玉米糝375 g、白胡椒1.58 g、花椒1.58 g 和食鹽18.75 g 各5 份，混合攪拌均勻備用，準(zhǔn)備5 份，編號(hào)為A1～A5。其中，A1～A4 分別稱取剁碎后的小米椒、二荊條、菜椒和芹菜各113 g，再次攪拌均勻后裝入泡菜壇中，并在壇口均勻噴灑4 mL 白酒封口，置于20 ℃恒溫密封發(fā)酵30 d。A5 除不添加任何蔬菜外，其他制作流程和A1～A4 相同。

1.2.2 鲊廣椒滋味指標(biāo)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取30 g 鲊廣椒和70 g 蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚝?0000 r/min 離心5 min，取上清液使用快速濾紙過(guò)濾后于4 ℃靜置12 h 后，吸取上清液儲(chǔ)存于測(cè)試杯中備用。參照張逸舒等的測(cè)試參數(shù)進(jìn)行設(shè)置，每份鲊廣椒樣本平行測(cè)定4 次，取后3 次測(cè)試數(shù)據(jù)為本研究的數(shù)據(jù)。

1.2.3 鲊廣椒風(fēng)味指標(biāo)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取20 g 鲊廣椒存于樣品瓶中，50 ℃水浴加熱20 min，置于室溫平衡20 min 后進(jìn)行風(fēng)味品質(zhì)的測(cè)定。電子鼻測(cè)試參數(shù)參照尚雪嬌等的方法進(jìn)行設(shè)置，每份樣本重復(fù)測(cè)試3 次，測(cè)試時(shí)間為90 s，響應(yīng)曲線在45 s 后達(dá)到穩(wěn)定，取59、60 和61 s 響應(yīng)值的平均值構(gòu)建電子鼻數(shù)據(jù)矩陣用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 宏基因組DNA 提取和擴(kuò)增 稱取3 g 左右的鲊廣椒樣本，使用試劑盒進(jìn)行微生物DNA 提取，對(duì)提取的DNA 產(chǎn)物質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。以16S rRNA V3～V4 序列為靶點(diǎn)，將檢驗(yàn)合格的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體擴(kuò)增參數(shù)參照王玉榮等的方法進(jìn)行設(shè)置。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物的純度和濃度進(jìn)行檢驗(yàn)，并將檢驗(yàn)合格的DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 將下機(jī)的原始序列依據(jù)雙端序列的重疊關(guān)系進(jìn)行拼接，并依照標(biāo)簽信息對(duì)拼接后的序列進(jìn)行歸并和質(zhì)控。使用QIIME（v1.70）平臺(tái)，參照Yang 等對(duì)干酪中細(xì)菌多樣性的分析流程，對(duì)樣本細(xì)菌多樣性和物種構(gòu)成進(jìn)行解析。主要步驟如下：a.使用PyNAST 軟件對(duì)質(zhì)控后的測(cè)序序列進(jìn)行校準(zhǔn)和比對(duì)；b.分別按照100%和97%的相似度進(jìn)行序列劃分，構(gòu)建操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU），并使用ChimeraSlayer軟件對(duì)OTU 中的嵌合體序列進(jìn)行識(shí)別和刪除；c.對(duì)OTU 代表性序列的分類學(xué)地位注釋和微生物多樣性計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

基于電子舌和電子鼻數(shù)據(jù)使用PAST 軟件對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行聚類分析；使用普氏分析（Procurstes analysis）對(duì)鲊廣椒菌群和品質(zhì)進(jìn)行共變化分析；使用Pearson 相關(guān)性分析和威爾科克森檢驗(yàn)（Wilcoxon Test）對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（平均相對(duì)含量大于1.00%）與品質(zhì)指標(biāo)之間的相關(guān)性及顯著性進(jìn)行分析，并使用熱圖（heatmap）進(jìn)行數(shù)據(jù)的可視化。使用R 軟件和Origin 2017b 軟件進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 類辣椒制作鲊廣椒中細(xì)菌多樣性的解析

本研究按100%和97%劃分OTU，并去除15個(gè)嵌合體OTU 后共得到3142 個(gè)OTU，每個(gè)樣本的平均OTU 數(shù)為628。三類辣椒制作鲊廣椒細(xì)菌16S rRNA 測(cè)序結(jié)果和多樣性分析結(jié)果如表1 所示。

由表1 可知，不添加蔬菜制作的鲊廣椒細(xì)菌群系辛普森指數(shù)最低，而添加芹菜或菜椒制作的鲊廣椒超1 指數(shù)和辛普森指數(shù)普遍較高。超1 指數(shù)和辛普森指數(shù)常被用來(lái)對(duì)樣本中的物種豐度和多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。由此可見(jiàn)，在制作鲊廣椒時(shí)添加蔬菜的種類可能會(huì)對(duì)鲊廣椒發(fā)酵過(guò)程中微生物的群系產(chǎn)生影響。較之空白組，添加芹菜、菜椒和二荊條的鲊廣椒其細(xì)菌群系的多樣性和豐度均較高，究其原因可能在于蔬菜的添加一方面增加了鲊廣椒的含水量，另一方面蔬菜表面攜帶的微生物可能也參與了鲊廣椒的發(fā)酵。由表1 可知，添加小米椒制作的鲊廣椒超1 指數(shù)最低，原因可能在于小米椒辣度在30000～50000 SHU，其含有的抑菌物質(zhì)在一定程度抑制了發(fā)酵體系中細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖。

表1 不同樣本細(xì)菌16S rRNA 測(cè)序結(jié)果和α 多樣性分析Table 1 16S rRNA sequencing results and α diversity analysis in different samples

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，5 類樣本共鑒定到46 個(gè)細(xì)菌屬，3 類辣椒制作鲊廣椒中相對(duì)含量大于1.00%優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的比較分析如圖1 所示。

由圖1 可知，添加二荊條和菜椒制作的鲊廣椒主要以為主，其平均相對(duì)含量分別為77.53%和94.41%。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)湖北省宜昌市當(dāng)陽(yáng)地區(qū)以二荊條辣椒和大米為主要原料制作的鲊廣椒亦以為主，這與本研究的結(jié)果一致，進(jìn)一步采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)在“種水平”上對(duì)當(dāng)陽(yáng)地區(qū)樣品分析發(fā)現(xiàn)，其中的主要由破布子乳桿菌（）、食品乳桿菌（）和副短乳桿菌（）構(gòu)成。值得一提的是，添加芹菜制作的鲊廣椒亦以為主，其平均相對(duì)含量為94.49%。Deshpande等和Pérez-Díaz 等的研究指出，發(fā)酵果蔬制品中的乳酸菌主要來(lái)源于果蔬樣品本身，其通過(guò)附著在果蔬的表面進(jìn)入發(fā)酵體系，從而改善整個(gè)發(fā)酵體系菌群的結(jié)構(gòu)。值得注意的是，添加小米椒制作的鲊廣椒以假單胞菌（）為主，其平均相對(duì)含量為67.35%。由此可見(jiàn)，蔬菜表面的菌群和小米椒自身含有的辣椒素等抑菌物質(zhì)的含量直接影響著鲊廣椒中的菌群結(jié)構(gòu)。隸屬于變形菌門（Proteobacteria），而Claesson 等發(fā)現(xiàn)Proteobacteria 中包含很多致病菌或條件致病菌，若消費(fèi)者食用了含有這些微生物類群的發(fā)酵食品可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生輕微的炎癥。綜上所述，小米椒不適于鲊廣椒的加工。

圖1 不同樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬的比較分析Fig.1 Comparative analysis of dominant bacterial genera in different samples

2.2 基于仿生設(shè)備對(duì)鲊廣椒品質(zhì)的解析

本研究進(jìn)一步使用電子舌和電子鼻技術(shù)對(duì)鲊廣椒的品質(zhì)進(jìn)行了數(shù)字化評(píng)價(jià)，并對(duì)鲊廣椒的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。鲊廣椒滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的點(diǎn)圖如圖2 所示。

圖2 不同樣本各滋味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的比較的分析Fig.2 Comparative analysis of relative intensity of taste indexes in different samples

由圖2 可知，3 類辣椒制作的鲊廣椒在后味A（澀味的回味）、后味B（苦味的回味）和豐度（鮮味的回味）上差異不明顯，其差異主要體現(xiàn)在酸味、苦味、澀味、咸味和鮮味上，尤其是在酸味上的差異最大。較之小米椒制作的鲊廣椒，二荊條和菜椒制作的鲊廣椒酸味明顯偏高，結(jié)合圖1 分析可知，這可能與小米椒抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。由圖2 亦可知，較之小米椒制作的鲊廣椒，二荊條和菜椒制作的鲊廣椒苦味、咸味和鮮味則明顯下降。

本研究進(jìn)一步對(duì)鲊廣椒的風(fēng)味指標(biāo)進(jìn)行了比較分析，鲊廣椒風(fēng)味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的雷達(dá)圖如圖3所示。

圖3 不同樣本各風(fēng)味指標(biāo)相對(duì)強(qiáng)度的雷達(dá)圖Fig.3 Radar plot of relative intensity of aroma index in different samples

由圖3 可知，傳感器W1S（對(duì)甲烷靈敏）、W1W（對(duì)有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)靈敏）和W5S（對(duì)氮氧化物靈敏）對(duì)3 類辣椒制作鲊廣椒的響應(yīng)差異較大，傳感器W2S（對(duì)乙醇靈敏）、W2W（對(duì)有機(jī)硫化物靈敏）、W1C（對(duì)芳香類物質(zhì)靈敏）、W3C（對(duì)芳香類物質(zhì)靈敏）和W5C（對(duì)烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏）等5 個(gè)傳感器對(duì)不同鲊廣椒的響應(yīng)差異較小，而傳感器W3S（對(duì)烷烴靈敏）和W6S（對(duì)氫氣有選擇性）2 個(gè)傳感器的響應(yīng)無(wú)明顯差異。較之小米椒制作的鲊廣椒，由二荊條和菜椒制作的鲊廣椒其芳香類物質(zhì)的含量明顯偏高，而揮發(fā)性物質(zhì)中有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和氮氧化物等含量明顯偏低，究竟原因可能在于小米椒抑制了鲊廣椒中的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致其產(chǎn)生的芳香類物質(zhì)種類或含量減少。

2.3 3 類辣椒制作鲊廣椒中微生物多樣性的解析

越來(lái)越多的報(bào)道顯示，發(fā)酵制品的品質(zhì)與環(huán)境微生物有著密切的聯(lián)系。為了解和驗(yàn)證鲊廣椒中菌群和品質(zhì)之間的聯(lián)系，本研究采用Procurstes 分析對(duì)鲊廣椒中菌群和品質(zhì)之間的共變化趨勢(shì)進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4 所示。

由圖4a 和圖4b 可知，添加芹菜、菜椒和二荊條制作的鲊廣椒細(xì)菌類群和品質(zhì)均較為相似。由圖4c 可知，基于菌群和品質(zhì)數(shù)據(jù)的同一樣本在空間上的排布具有一定的重疊性，且經(jīng)Mantel 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者的共變化趨勢(shì)顯著（＜0.05）。由此可見(jiàn)，通過(guò)影響鲊廣椒中細(xì)菌類群的結(jié)構(gòu)，不同種類的辣椒可對(duì)鲊廣椒的風(fēng)味和滋味品質(zhì)產(chǎn)生影響。本研究進(jìn)一步對(duì)各樣本中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬與品質(zhì)之間的相關(guān)性和顯著性進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果如圖5 所示。

圖4 基于OTU 水平的各樣本菌群（a）及品質(zhì)（b）的聚類分析和Procurstes 分析（c）Fig.4 Cluster analysis of the OTU-based flora (a) and quality(b),and Procurstes analysis (c)

圖5 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬和樣本品質(zhì)的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of dominant genera and quality of samples

由圖5 可知，與傳感器W2W 響應(yīng)強(qiáng)度呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），而和不動(dòng)桿菌屬（）與傳感器W2W 響應(yīng)強(qiáng)度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（＜0.05），即隨著發(fā)酵體系中含量的增加或含量的減少，樣本揮發(fā)性物質(zhì)中有機(jī)硫化物的含量會(huì)顯著降低（＜0.05）。由圖5 亦可知，梭菌屬（）與傳感器W1S、W5S、W1W 和W2S 響應(yīng)強(qiáng)度及后味A 和咸味呈顯著正相關(guān)（＜0.05），而與傳感器W1C、W3C 和W5C 響應(yīng)強(qiáng)度呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），這說(shuō)明鲊廣椒中含量過(guò)高會(huì)降低鲊廣椒的風(fēng)味品質(zhì)。由此可見(jiàn)，提升鲊廣椒發(fā)酵體系中的含量能明顯抑制鲊廣椒中的不良風(fēng)味，提升芳香類物質(zhì)的含量，而其他優(yōu)勢(shì)菌屬均與有機(jī)硫化物等不良風(fēng)味物質(zhì)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（＜0.05）。Dan等的研究結(jié)果與本研究相似，其發(fā)現(xiàn)能利用發(fā)酵基質(zhì)中的碳水化合物產(chǎn)生各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，改善產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。

結(jié)合圖1 分析可知，添加二荊條辣椒和菜椒制作的鲊廣椒均以為主，因而通過(guò)提高鲊廣椒發(fā)酵體系中的含量，添加兩類辣椒可顯著提升鲊廣椒的品質(zhì)。鲊廣椒因其酸辣的口感而廣受歡迎，適宜的酸度和辣度對(duì)于鲊廣椒的整體品質(zhì)至關(guān)重要，二荊條辣度在5000～15000 SHU，菜椒的辣度低于500～1000 SHU，而芹菜的辣度幾乎為0 SHU，因而在鲊廣椒制作過(guò)程中添加二荊條會(huì)使產(chǎn)品品質(zhì)更被消費(fèi)者接受，此結(jié)果也與農(nóng)戶制作鲊廣椒的經(jīng)驗(yàn)相一致。

3 結(jié)論

本研究對(duì)小米椒、二荊條辣椒和菜椒制作鲊廣椒的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小米椒制作的鲊廣椒以為主，揮發(fā)性物質(zhì)中有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和氮氧化物等含量明顯偏高。二荊條和菜椒制作的鲊廣椒以為主，細(xì)菌群系的多樣性和豐度均較小米椒制作的鲊廣椒高，且鲊廣椒的酸味和芳香類物質(zhì)的含量明顯偏高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，提升鲊廣椒發(fā)酵體系中的含量能明顯抑制鲊廣椒中的不良風(fēng)味，提升芳香類物質(zhì)的含量。鲊廣椒因口味“酸辣”而深受消費(fèi)者喜愛(ài)，然而菜椒辣度較低，所以二荊條辣椒更適合于鲊廣椒的制作。