獼猴桃和青菜病原真菌的分離、鑒定及生物學特性

李佩琪，江 山，戴 群，衛 蔚，林 潔,

（1.江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，江蘇省生物功能分子重點實驗室，江蘇南京 210013；2.南京理工大學環境與生物工程學院，江蘇南京 210094）

果蔬因其富含糖類、維生素及蛋白質，具有很高的經濟價值和營養價值，但常常會被病原菌侵染。據統計，由病原菌造成的折損占果蔬生產總折損的50%以上。果蔬中的病原菌包括細菌、真菌、病毒，它們都能引發果蔬病害。其中，真菌占病原菌中的70%～80%。目前，植物病原菌的防治方法主要有：使用抗病品種、化學防治和生物防治。使用果蔬抗病品種可以進行有效的防治，但研究周期長、難度大且抗性易丟失；化學防治是目前主要手段，但高效低毒的殺菌劑品種少、易造成環境污染；而生物防治具有良好的防治效果和前景，是當今研究的熱點。了解植物病原菌是生物防治的前提。因此，研究植物病原菌的種類及性質對果蔬防腐具有重要意義。

獼猴桃（Planch.）是獼猴桃科獼猴桃屬植物，因其口味獨特、營養豐富而受到人們的青睞。然而，獼猴桃果實貯藏期間易于腐爛，采后腐爛率高達約35%。一直以來，有許多學者致力于獼猴桃病原菌的分離與鑒定，如Romanazzi發現可以引起的獼猴桃果實灰霉病，王忠肅等首次發現pv.是引起獼猴桃潰瘍病的病原菌。Li 等認為葡萄座腔菌為獼猴桃軟腐病優勢致病菌。以上研究結果均表明，獼猴桃腐爛是由多種病原菌引起的，不同地域之間的優勢菌株不盡相同，而大多數的研究對于獼猴頭病原菌缺少致病性鑒定方面的實驗。

青菜（var.）隸屬十字花科蕓苔屬（L.），培植歷史悠久，在我國各地均有栽培，而在江浙滬種植較多。蕓苔屬約含40 多個種，屬內包含許多重要的蔬菜、油料及飼料作物。目前對該屬中大白菜病害的研究較多，包括霜霉菌引起白菜霜霉病，鏈格孢屬（）真菌引起白菜黑斑病，希金斯刺盤孢菌引起白菜炭疽病，假單胞菌屬細菌sp.引起白菜角斑病，野油菜黃單胞屬細菌引起白菜黑腐病，胡蘿卜軟腐果膠桿菌引起白菜軟腐病等。但目前關于同屬于蕓苔屬的青菜，研究工作主要集中在抗病性品種選育和品性分析方面，對于其病原菌，尤其是病原真菌的研究很少。

因此，本研究擬對獼猴桃和青菜這兩種成分不同，但經濟價值均高的果蔬進行病原真菌鑒定，并且對其病原真菌進行致病性及生物學特性進行研究，來探索不同品種的果蔬之間是否具有共性病原真菌，為果蔬的存儲及病害的防治提供理論與實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃 2020 年3 月網購自陜西省西安市周至縣的完整且無病害的獼猴桃，經揚州大學李熠教授鑒定為翠香獼猴桃品種（原代號西獼9 號）；青菜2020 年3 月網購自安徽省黃山市的完整且無病害的青菜，經揚州大學李熠教授鑒定為上海青品種；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 杭州百思生物技術有限公司；乳酸石碳酸棉藍染液 南京森貝伽生物科技有限公司；Lysis Buffe、DNA Marker（DL 2000）、Premix Taq

美谷生物科技有限公司；50×TAE 電泳緩沖液、Loading Buffer Solarbio；瓊脂糖 西格瑪奧德里奇貿易有限公司；引物ITS4（5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGG-3′）和ITS5（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）南京金斯瑞生物科技有限公司；核酸染料生工生物工程股份有限公司。

SW-CJ-2F 雙人超凈工作臺、GZX-9240MBE 電熱鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DNP61 電熱恒溫培養箱 上海鴻都電子科技有限公司；YXQ-LS-70A 立式壓力蒸汽滅菌器 南京博惠科學儀器有限公司；ESE6539TA 冰柜 海爾有限公司；BSA24S 分析天平 昆山艾思博格電子科技有限公司；DYY-6C 三恒多用電泳儀 北京市六一儀器廠；S1000 PCR 擴增儀 Biorad；TGL-16C 臺式高速離心機 常州邁科諾儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 獼猴桃及青菜病原真菌的分離純化 將購買的獼猴桃、青菜室溫存放，等待其發病并觀察發病情況；取樣：在肉眼可見發生病害的獼猴桃果皮和青菜葉片的病健交界處切取大小為3 mm×3 mm 的組織塊；消毒：用清水沖洗組織塊，然后在超凈工作臺下進行組織塊消毒（用75%的酒精中消毒30 s；用2%消毒水浸泡消毒30 s；用無菌水沖洗3～6 次；置于無菌濾紙上晾干）；分離培養：將消毒處理后的組織塊置于PDA 固體培養基上（添加抗生素），此步驟要確保平板倒置后的組織塊不會掉落，同時將最后一次漂洗的無菌水作對照，檢驗是否消毒合格；純化培養：將培養基置于28 ℃智能生化培養箱培養3～5 d，待長出菌落后挑取菌落邊緣少量菌絲，置于PDA 固體培養基中劃線純化，重復上述步驟，直至獲得單一菌落；保種：將純化后的菌株保存于PDA 斜面培養基上，同上培養直至菌落長出，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 致病性鑒定 實驗材料為完整且無病害的獼猴桃和青菜，并且用75%酒精擦拭。用滅菌的針蘸取分離得到的菌株分別刺傷完整且無病害的獼猴桃和青菜上，每株菌三個平行。將接種好的獼猴桃和青菜置于滅菌的自封袋中，再放入28 ℃培養箱內，觀察獼猴桃和青菜的發病情況。用滅菌的針蘸取0.85%的無菌生理鹽水刺傷同樣完整且無病害的獼猴桃和青菜作為空白對照。

1.2.3 獼猴桃及青菜病原真菌種屬鑒定 形態學鑒定：用滴管吸取適量染液（乳酸石碳酸棉藍）于載玻片上，用解剖針挑取少量菌絲置于染液滴上，隨后將菌絲分散，蓋上蓋玻片，等待2～3 min。再將制作的玻片置于數碼顯微鏡下40 倍觀察。最后根據《真菌鑒定手冊》工具書進行初步鑒定。

ITS 鑒定：在超凈臺中用滅菌牙簽挑取肉眼可見的菌體加入到裝有50 μL 的Lysis Buffer 的5 mL離心管中，充分混勻后在80 ℃水浴中孵育15 min，放冰上冷卻。最后將1.5 mL 離心管在12000 r/min條件下離心30 s，取上清液用作菌落PCR 的模板。按照比例加入模板、引物、雙蒸水和Taq 酶，再進行菌落PCR。使用1×TAE 緩沖液配制1.0%瓊脂糖，倒入制膠槽內，冷卻拔去梳子。點樣孔每孔加入5 μL 的DNA 樣品（含1 μL 的6×DNA Loading Buffer），對照孔加入5 μL Marker（DL 2000）作為分子量標準對照。穩壓電泳（120 V，100 mA）約30 min。將跑完電泳的瓊脂糖凝膠利用紫外線分析儀觀察、照相。最后將PCR 產物送去南京思普金生物科技有限公司測序。利用MAGA 6.06 構建系統發育樹進行分析并與真菌的形態學觀察結果相互驗證。

1.2.4 獼猴桃及青菜病原真菌的生物學特性研究

1.2.4.1 溫度對病原菌菌落生長的影響 將7 株菌分別接種于PDA 培養基的圓心，分別放置于4、10、15、20、25、28 和30 ℃恒溫培養箱中培養，每個溫度重復三次。培養5 d 后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4.2 pH 對病原菌菌落生長的影響 用HCl 和NaOH 將PDA 培養基的pH 調成4、5、6、7、8、9和10。將7 株菌分別接種于不同pH 的PDA 培養基的圓心。每個pH 重復三次。培養5 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 數據處理

試驗數據顯著差異性分析用Microsoft Excel 2016 軟件進行，并采用GraphPad Prism 9.0.0 軟件做圖。采用MEGA 6.06 軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃和青菜病原真菌的分離和純化

從發病獼猴桃和發病青菜分離得到的菌落，純化后得到7 株真菌，分別編號為M-1、M-2、M-3、M-4、Q-1、Q-2 和Q-3（圖1），其中M-1、M-2、M-3和M-4 從發病獼猴桃中分離得到，Q-1、Q-2 和Q-3從發病青菜中分離得到。

圖1 7 株真菌的菌落形態Fig.1 Colony morphology of seven strains of fungi

2.2 致病性鑒定結果

將從獼猴桃中分離出的病原菌M-1、M-2、M-3 和M-4 用針刺法分別接種于完整且無病害的獼猴桃上。5 d 后，獼猴桃產生發病癥狀（圖2A～2D），而對照組無發病情況（圖2E）。將從青菜中分離出的病原菌Q-1、Q-2 和Q-3 用針刺法分別接種于完整且無病害的青菜上，5 d 后青菜產生發病癥狀（圖2F～2H），而對照組無發病情況（圖2I）。研究發現7 株病原菌均能相應的引起這兩種果蔬腐爛：接種M-2、M-3 和M-4 菌株的獼猴桃的發病部位出現黑色水浸狀病斑，果皮著生大量白色絨毛狀菌絲，與原始的發病癥狀近一致，而接種M-1 菌株的獼猴桃發病部位呈現半透明狀態，果皮消失，并出現少量白色絨毛狀菌絲，與原始的發病癥狀存在差異；接種Q-1、Q-2 和Q-3 菌株的青菜的發病部位出現黑色病斑，腐爛部位呈現半透明狀態。

圖2 7 株病原菌分別接種后獼猴桃和青菜的發病癥狀Fig.2 The symptoms of kiwifruit and vegetable after inoculation with 7 strains of pathogenic bacteria respectively

2.3 獼猴桃及青菜病原真菌的種屬鑒定

2.3.1 形態學鑒定結果 對7 株病原菌進行顯微觀察（圖3）后發現，Q-3 和M-3 的顯微特征相似，為同一屬的菌株。其他5 種菌株的顯微特征各異。結合《真菌鑒定手冊》（表1～表2）發現，這7 株菌為6 種，隸屬2 門、5 目、6 科、6 屬。菌Q-1 和Q-2 都為半知菌亞門，菌Q-3、M-1、M-2、M-3 和M-4 都為盤菌亞門（其中菌M-1 和M-4 同為糞殼菌綱）。

表1 獼猴桃及青菜病原真菌顯微特征Table 1 Microscopic characteristics of pathogenic fungi of kiwifruit and pakchoi

表2 獼猴桃及青菜病原真菌鑒定結果Table 2 Identification of pathogenic fungi in kiwifruit and pakchoi

圖3 7 株病原真菌的形態特征Fig.3 Microscopic observation characteristics of seven pathogenic fungi

2.3.2 分子鑒定結果 病原真菌ITS 片段的PCR 擴增結果：以獲得的7 株病原真菌的基因組DNA 為模板，以ITS4 和ITS5 為通用引物，進行PCR 擴增，隨后將擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測?？梢钥闯鯬CR 擴增得到的片段長度大小為500～750 bp且無雜帶（圖4），符合測序要求。

圖4 PCR 擴增序列電泳圖Fig.4 Electrophoretic image of PCR amplification sequence

測序結果：將經公司測序得到的病原真菌的序列錄入NCBI 進行Blast 序列比對，并將病原真菌的序列與對比得出的同源性序列在MEGA 6.06 軟件上用鄰近法構建系統發育樹。（圖5）。M-1 位于殼囊孢屬（sp.）分支，M-2 位于波蘭青霉（）分支，M-3 與Q-3 同位于加州灰霉菌（）分支，M-4 位于蓋姆斯木霉（）分支，Q-1 位于圓形鐮刀菌（）分支，Q-2 位于枝孢梭菌（）分支，對比序列的同源性均達97%以上。結合形態學鑒定結果，可判定此次分離得到的獼猴桃病原真菌為殼囊孢屬（sp.）、波蘭青霉（）、加州灰霉菌（）和蓋姆斯木霉（），青菜病原真菌為圓形鐮刀菌（）、枝孢梭菌（）和加州灰霉菌（）。

圖5 7 株病原真菌基于ITS 序列的構建的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of seven pathogenic fungi based on ITS

2.4 病原真菌生物學特性研究

2.4.1 溫度對病原真菌生長的影響 不同溫度對7 株病原真菌的生長影響有顯著性差異（＜0.05）。M-1 在10～28 ℃范圍內可以生長，其余6 株菌在4～30 ℃范圍內均可以生長。并且除M-1 外，其余6 株菌的最適生長溫度均為20～28 ℃。一般冰箱的冷藏溫度為4 ℃，若蔬果本身帶有病原真菌，冰箱冷藏的溫度并不能防止這些病原真菌侵染蔬果，放入冰箱的冷藏室并不能讓蔬果長久保鮮，只可能減緩病原真菌侵染的速度（圖6）。

圖6 不同溫度對病原真菌生長的影響Fig.6 Effects of different temperatures on the growth of pathogenic fungi

2.4.2 pH 對病原菌真菌落生長的影響 不同pH 對7 株病原真菌的生長影響有顯著性差異（＜0.05）。除Q-2 外，其余6 株菌株的最適pH 在6～8 之間。Q-2 的耐酸性較好，其最適pH 可能在4 以下。Q-1的耐堿性最好，在pH 為10 的情況下，菌落生長的直徑平均值為5.5 cm。（圖7）

圖7 不同pH 對病原真菌生長的影響Fig.7 Effects of different pH treatments on the growth of pathogenic fungi

3 結論

本研究對從發病獼猴桃和發病青菜中分離純化得到的菌株進行致病性鑒定，發現這7 株真菌均能夠對應地引起獼猴桃和青菜腐爛。通過形態學結合ITS 鑒定，確定從發病獼猴桃分離出的4 株病原真菌為殼囊孢屬sp.、波蘭青霉、加州灰霉菌和蓋姆斯木霉，確定從發病青菜分離出的3 株病原真菌為圓形鐮刀菌、枝孢梭菌和加州灰霉菌。加州灰霉菌可以同時引起獼猴桃和青菜腐爛，灰霉菌是常見的植物病原真菌，對于多種果蔬均有危害。在蔬果儲運過程中，這類致病菌可以引起大規模的腐爛，甚至會導致多種蔬菜水果同時腐爛，對其防治應該更加重視。本研究測定了7 株病原真菌的最適宜的溫度和pH，為獼猴桃和青菜腐病發生規律和防治研究奠定了較好的基礎。研究結果表明20～28 ℃，pH 為6～8 的條件有利于獼猴桃和青菜的大部分病原真菌生長。研究還發現枝孢梭菌的耐酸性較強，最適生長pH 可能在4 以下。波蘭青霉、加州灰霉菌、蓋姆斯木霉和枝孢梭菌在4 ℃的情況下均可以生長，并且加州灰霉菌和蓋姆斯木霉生長較快，說明冰箱冷藏的溫度并不能防止這些病原菌侵染蔬果。

綜上所述，本研究對獼猴桃和青菜腐病病原真菌進行分離純化、致病性鑒定、種屬鑒定及生物學特性的測定。確定了獼猴桃和青菜的病原真菌的種類和其生物學特性，本文研究結果為獼猴桃及青菜病原菌的防治提供參考依據。