基于三種多糖與酪蛋白復(fù)配制備W/O/W 型乳液及其包封紅景天苷效果的研究

陳 松，張國芳，張 彤，劉麗波，杜 鵬，李艾黎，李 春

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030）

紅景天苷（salidroside，SAL）是紅景天中主要的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗疲勞、抗癌、抗微波輻射和預(yù)防急性高原病等多種藥理性質(zhì)，是目前極具前景的功能性食品成分。然而SAL 在加工、貯藏及機(jī)體消化吸收過程中，易受到溫度、pH 等因素的影響，使其生物活性很難保持。此外，SAL 的高溶解度與低滲透性，容易引起P-糖蛋白在腸粘膜中的外排效應(yīng)，導(dǎo)致生物利用度下降，極大地限制了SAL 在食品與醫(yī)藥中的應(yīng)用。因此需要根據(jù)紅景天苷的這些理化特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出有效的遞送載體，以提升紅景天苷的穩(wěn)定性，延緩其釋放，提高生物利用度，確保功效。

多重乳液是乳液進(jìn)一步乳化成的復(fù)雜乳液體系，有水包油包水（W/O/W）和油包水包油（O/W/O）兩種類型，具有“兩膜三相”結(jié)構(gòu)，即內(nèi)油/水界面膜、外水/油界面膜以及內(nèi)相、中間相和外相。目前，W/O/W 型多重乳液已被證明是保護(hù)親水性生物活性物質(zhì)穩(wěn)定性及控制釋放的最佳體系，它將藥物溶于內(nèi)水相并包裹在油相中，增強(qiáng)跨膜能力，提高緩釋效果，保持藥物在體內(nèi)保留時(shí)間。盡管W/O/W型多重乳液是動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定系統(tǒng)，但加工過程中，液滴外層會(huì)發(fā)生氧化，降解為單相乳液。因此，需使用生物聚合物定制技術(shù)，設(shè)計(jì)有特殊性質(zhì)的納米顆粒，改變其穩(wěn)定性和加工能力。例如引入蛋白質(zhì)和多糖，能夠提高乳液在環(huán)境應(yīng)力與加工條件下的穩(wěn)定性。酪蛋白是親水性乳化劑，可用于穩(wěn)定W/O/W 型多重乳液中油滴的外表面。但蛋白質(zhì)穩(wěn)定的多重乳液對(duì)pH 和離子強(qiáng)度高度敏感，當(dāng)pH 接近蛋白等電點(diǎn)或離子強(qiáng)度超過一定水平時(shí)，多重乳液不穩(wěn)定。此時(shí)添加適量多糖可以在一定程度上克服該缺點(diǎn)，常見的多糖壁材有葡聚糖、殼聚糖和大豆多糖等。Esfanjani 等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和多糖組合應(yīng)用時(shí)會(huì)使乳液的化學(xué)與膠體穩(wěn)定性顯著增加，且多糖會(huì)增加乳液粘度，表現(xiàn)出更優(yōu)異的乳化性能。Li等發(fā)現(xiàn)乳清分離蛋白與羧甲基纖維素形成的混合物會(huì)吸附在油水界面處，提高膜的厚度及韌性，避免內(nèi)外水相轉(zhuǎn)移和滲透以及絮凝現(xiàn)象的發(fā)生，進(jìn)而提高多重乳液的穩(wěn)定性。在乳制品中，目前采用多重乳液包埋SAL 的研究鮮有報(bào)道。

本研究分別以葡聚糖、水溶性殼聚糖和大豆多糖混合酪蛋白作為外水相對(duì)SAL 進(jìn)行包埋，考察W/O/W型多重乳液穩(wěn)定性的變化、SAL 包埋率和載藥量，并測(cè)定包埋后的SAL 在模擬消化過程中的釋放率。旨在確定一種W/O/W 型微載體系統(tǒng)，增加SAL 在貯藏和加工過程中的穩(wěn)定性，提升緩釋效果及生物利用率，為功能性產(chǎn)品的開發(fā)利用提供科學(xué)理論。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅景天苷（98%）、葡聚糖（98%）上海麥克林生化科技有限公司；聚甘油蓖麻醇酯（polyglycerol polyricinoleate，PGPR）鄭州明瑞化工產(chǎn)品有限公司；菜籽油 超市購買；酪蛋白（≥90%）、水溶性殼聚糖（98%）北京博奧拓達(dá)科技有限公司；水溶性大豆多糖（98%）上海譜科生物技術(shù)有限公司；十二烷基硫酸鈉（≥98.5%）、色譜級(jí)甲醇 Sigma 公司；-淀粉酶（酶活力≥5 U/mg）、尿素（分析純）、粘液素（BR）、胃蛋白酶（酶活力30000 U/g）、脂肪酶（酶活力30000 U/g）、胰酶（酶活力4000 U/g）、膽汁鹽（BR）上海源葉生物科技有限公司；溴酚藍(lán)、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、碳酸氫鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、氯化鈣、氯化銨、磷酸二氫鉀、氯化鎂 以上試劑均為分析純，西隴化工股份有限公司。

1260Ⅱ Prime 高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；HJ-4B 恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇市中大儀器廠；LE438-pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GLH-220 型高速乳化均質(zhì)機(jī) 美國Omni 公司；Nano-ZS90 粒度及電位分析儀 英國Malvern 公司；SpectraMax reg iD3 酶標(biāo)儀 美谷儀器（上海）有限公司；BA300 型數(shù)碼顯微鏡 Motic 公司；ZQPW-70 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；GL-20G Ⅱ型高速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 W/O/W 型多重乳液的制備 將SAL 添加到0.6%（w/v）NaCl 溶液中攪拌至溶解，制得1%（w/v）SAL 內(nèi)水相溶液。將8%（w/v）PGPR 添加到菜籽油中攪拌溶解，制得油相溶液。在室溫條件下分別將不同濃度（0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，w/v）的葡聚糖、水溶性殼聚糖和大豆多糖與3%（w/v）酪蛋白溶解于去離子水中，用恒溫磁力攪拌器攪拌至完全溶解，通過1 mol/L 的氫氧化鈉或鹽酸調(diào)至pH=7，放置過夜以確保水合完全。參考Li 等的方法，采用兩步乳化法制備多重乳液：首先將30%的內(nèi)水相逐滴加入到70%的油相中，用高速乳化均質(zhì)機(jī)在10000 r/min 條件下剪切5 min。再將30%的W/O乳狀液加入到70%的外水相中，用高速乳化均質(zhì)機(jī)在5000 r/min 條件下剪切3 min，制得W/O/W 型多重乳液。

1.2.2 W/O/W 型多重乳液的微觀結(jié)構(gòu) 取適量多重乳液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，使用顯微鏡以100 倍油鏡觀察多重乳液的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.3 粒徑和電位的測(cè)定 參考Yuan 等的測(cè)定方法，用去離子水將多重乳液稀釋1000 倍后立即測(cè)定粒徑和電位，參數(shù)設(shè)置為：He-Ne 光源，功率5 mW，波長為640 nm，散射角90°，測(cè)試時(shí)間3 min，測(cè)定溫度25 ℃。

1.2.4 貯藏穩(wěn)定性的測(cè)定 參考Xu 等的方法，將制備的多重乳液轉(zhuǎn)移到試管中，用蓋密封并在25 ℃條件下貯藏0、7、14 d，觀察多重乳液是否存在分層現(xiàn)象。

1.2.5 乳化性質(zhì)的測(cè)定 參考Li 等的方法并做修改，取100 μL 多重乳液加入2.4 mL 十二烷基硫酸鈉溶液（0.1%，w/v），用酶標(biāo)儀在500 nm 處測(cè)定吸光度A，計(jì)算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）。靜置30 min 后取下清液測(cè)定吸光度A，計(jì)算乳化活性穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）。計(jì)算公式：

式中，N 為稀釋倍數(shù)；C 為乳狀液形成前水溶液中蛋白質(zhì)濃度，g/L；? 為乳狀液中油相體積分?jǐn)?shù)。

1.2.6 SAL 包埋率與載藥量的測(cè)定 取4 g 多重乳液于5 mL 離心管中，以4000 r/min 離心15 min 后，取1.5 g 外水相用0.45 μm 水系膜過濾。參考Liang等的方法并改進(jìn)，采用高效液相色譜法測(cè)定樣品中SAL 含量，色譜條件：CBEH 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（15:85），體積流量為0.6 mL/min，柱溫30 ℃，通過紫外檢測(cè)器測(cè)定，檢測(cè)波長為275 nm，自動(dòng)進(jìn)樣溫度4 ℃，進(jìn)樣量10 μL。將SAL 標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.43 mg/mL 的標(biāo)品儲(chǔ)備液，使用時(shí)依次配制為梯度濃度的溶液，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積值。將峰面積值（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程Y=7238.8X+798.38，R=0.9997，表明SAL 線性關(guān)系良好。SAL的包封率（embedding rate，EE）和載藥量（drug loading，L）公式如下：

式中，G為制備時(shí)加入的SAL 總量（μg）；G為多重乳液中游離SAL 含量（μg）；M 為多重乳液的質(zhì)量（g）。

1.2.7 模擬體外消化

1.2.7.1 模擬消化液的配制 參考Flores 等的方法。模擬唾液：0.117 g/L 氯化鈉、2.1 g/L 碳酸氫鈉、0.149 g/L 氯化鉀、0.4 g/L 尿素、1 g/L 粘液素、2 g/L-淀粉酶，調(diào)節(jié)pH6.8±0.2；模擬胃液：5.504 g/L 氯化鈉、0.532 g/L 磷酸二氫鈉、1.648 g/L 氯化鉀、0.798 g/L氯化鈣、0.612 g/L 氯化銨、0.17 g/L 尿素、5 g/L 胃蛋白酶、6 g/L 粘液素、13 mL 濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH1.3±0.02；模擬腸液：14.024 g/L 氯化鈉、1.128 g/L 氯化鉀、6.776 g/L 碳酸氫鈉、0.16 g/L 磷酸二氫鉀、0.1 g/L氯化鎂、0.2 g/L 尿素、3 g/L 脂肪酶、18 g/L 胰酶、0.36 mL 濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH8.1±0.2；模擬膽汁：10.518 g/L氯化鈉、0.752 g/L 氯化鉀、11.57 g/L 碳酸氫鈉、0.5 g/L尿素、60 g/L 膽汁鹽、0.3 mL 濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH8.2±0.2。

1.2.7.2 模擬口腔消化 將多重乳液與模擬唾液1:1混合，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱（100 r/min）消化5 min。

1.2.7.3 模擬胃消化 將上一步所得消化液與模擬胃液1:1 混合，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱（100 r/min）消化2 h。

1.2.7.4 模擬腸消化 將上一步所得消化液與模擬腸液和膽汁液2:2:1 混合，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱（100 r/min）消化2 h。

1.2.7.5 模擬體外消化各階段SAL 釋放率的測(cè)定 將各階段體外模擬消化液通過1.2.6 中的方法進(jìn)行SAL消化后的包封率的測(cè)定，再參考Xu 等的方法測(cè)定各階段消化后的釋放率，計(jì)算釋放率（R）公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理組設(shè)置三個(gè)平行，采用Excel 進(jìn)行初步數(shù)據(jù)處理，通過SPSS Statistics 26 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用LSD 方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行多重比較分析，＜0.05 表示差異顯著，＞0.05 表示差異不顯著；使用Origin95 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖-酪蛋白對(duì)W/O/W 型多重乳液形態(tài)和粒徑的影響

乳液平均粒徑的大小是判斷乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。結(jié)合圖1 與圖2 可以發(fā)現(xiàn)，不同濃度的葡聚糖、水溶性殼聚糖和大豆多糖混合酪蛋白均可形成完整的“兩膜三相”結(jié)構(gòu)，即外水界面膜、內(nèi)油界面膜和外水相、油相、內(nèi)水相，符合標(biāo)準(zhǔn)的W/O/W 型多重乳液體系，且多糖的添加降低了多糖-酪蛋白多重乳液的平均粒徑，隨多糖濃度的增加，多重乳液平均粒徑均呈先降低后升高的趨勢(shì)。酪蛋白對(duì)照組的多重乳液平均粒徑為871.3±19.48 nm，葡聚糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑顯著降低（＜0.05），介于623.03±5.21 nm 與648.9±2.35 nm 之間，當(dāng)葡聚糖濃度為1.2%時(shí)，葡聚糖-酪蛋白多重乳液的平均粒徑達(dá)到最小值。與對(duì)照組相比，多糖濃度為0.3%～0.6%的殼聚糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑顯著降低（＜0.05），但多糖濃度在0.9%～1.5%的殼聚糖-酪蛋白組與酪蛋白對(duì)照組多重乳液平均粒徑相比無顯著差異（＞0.05）。大豆多糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑介于694.53±36.8 nm 與770.07±21.92 nm 之間，顯著低于酪蛋白對(duì)照組多重乳液（＜0.05）。Assadpour 等研究表明當(dāng)外水相中乳化劑濃度升高時(shí)，能夠引起界面膜面積的增加，導(dǎo)致多重乳液粒徑減小。當(dāng)粒徑達(dá)到最小后，濃度繼續(xù)增加會(huì)使多余的乳化劑在界面堆積，多重乳液粒徑增大，降低乳液的穩(wěn)定性，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。結(jié)果表明，葡聚糖、大豆多糖和較低濃度殼聚糖的添加能夠顯著降低多重乳液的平均粒徑（＜0.05），在葡聚糖添加量為1.2%時(shí)，多重乳液的平均粒徑最小。

圖1 不同多重乳液的顯微鏡照片（10×100）Fig.1 Micrographs of different multiple emulsions（10×100）

圖2 含有不同濃度多糖的多重乳液的平均粒徑Fig.2 Average particle size of multiple emulsions containing different concentrations of polysaccharides

2.2 多糖-酪蛋白對(duì)W/O/W 型多重乳液電位的影響

越穩(wěn)定的溶液體系擁有越高的電位絕對(duì)值，一般認(rèn)為，體系中電位絕對(duì)值高于20 mV 就可以提供足夠的靜電斥力維持體系的穩(wěn)定。由圖3 可知，添加不同濃度三種多糖的多重乳液電位絕對(duì)值均顯著高于酪蛋白對(duì)照組多重乳液（＜0.05）。葡聚糖-酪蛋白多重乳液電位絕對(duì)值隨葡聚糖濃度增加先上升后下降，在葡聚糖濃度為1.2%時(shí)，電位絕對(duì)值最高，平均為-37.3±0.46 mV。殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白多重乳液電位絕對(duì)值提升幅度弱于葡聚糖-酪蛋白，且大豆多糖-酪蛋白優(yōu)于殼聚糖-酪蛋白，這可能與多糖種類有關(guān)。Jiang 等研究發(fā)現(xiàn)，添加多糖可以與某些帶正電的氨基酸反應(yīng)，導(dǎo)致負(fù)電荷增加，但是添加到一定濃度后，過量部分會(huì)與酪蛋白發(fā)生分子纏結(jié)等作用導(dǎo)致負(fù)電荷被屏蔽，電位絕對(duì)值降低。綜上說明添加葡聚糖、殼聚糖和大豆多糖均能顯著提高多重乳液電位絕對(duì)值，且提升幅度：葡聚糖＞大豆多糖＞殼聚糖。當(dāng)葡聚糖的添加量為1.2%時(shí)，多重乳液的電位絕對(duì)值最高，多重乳液穩(wěn)定性最好。

圖3 含有不同濃度多糖的多重乳液的電位Fig.3 Potential of multiple emulsions containing different concentrations of polysaccharides

2.3 多糖-酪蛋白對(duì)W/O/W 型多重乳液貯藏穩(wěn)定性的影響

如圖4 為常溫放置0、7、14 d 的W/O/W 型多重乳液的貯藏穩(wěn)定性情況，新鮮制備的多重乳液未見明顯分層。隨貯藏時(shí)間的延長，殼聚糖-酪蛋白與大豆多糖-酪蛋白多重乳液均發(fā)生了不同程度的絮凝現(xiàn)象。而葡聚糖濃度為0.9%、1.2%及1.5%的葡聚糖-酪蛋白多重乳液在0～14 d 內(nèi)未發(fā)生明顯的絮凝現(xiàn)象，由圖2 和圖3 可知，葡聚糖濃度為0.9%、1.2%及1.5%的葡聚糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑較小，電位絕對(duì)值較高。Yi 等認(rèn)為，電位越高，乳液定性越高，抗絮凝力強(qiáng)。結(jié)果顯示，添加高濃度的葡聚糖能夠明顯提升葡聚糖-酪蛋白多重乳液的貯藏穩(wěn)定性，而酪蛋白對(duì)照組、殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白多重乳液會(huì)發(fā)生絮凝。

圖4 貯藏期間多重乳液穩(wěn)定性的變化Fig.4 Changes of stability of multiple emulsions during storage

2.4 多糖-酪蛋白對(duì)W/O/W 型多重乳液乳化性質(zhì)的影響

乳化活性能夠表征蛋白質(zhì)吸附在油水界面并使其穩(wěn)定的能力，乳化穩(wěn)定性則是反映在一定時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)維持乳液穩(wěn)定的能力。如圖5 和圖6 所示，三種多糖-酪蛋白均能不同程度地提高多重乳液的EAI 和ESI，且添加三種多糖的多重乳液乳化性質(zhì)的變化趨勢(shì)與電位絕對(duì)值變化相似，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)葡聚糖的添加量為1.2%時(shí)，葡聚糖-酪蛋白多重乳液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性最高，顯著大于其他實(shí)驗(yàn)組（＜0.05）。殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白對(duì)多重乳液乳化活性和乳化穩(wěn)定性提升幅度弱于葡聚糖-酪蛋白，且大豆多糖-酪蛋白優(yōu)于殼聚糖-酪蛋白，與2.2 結(jié)果相似。Sun 等提出蛋白質(zhì)和多糖形成的復(fù)合物可以改變界面層的厚度、電荷密度和粘彈性等，葡聚糖能與酪蛋白結(jié)合形成緊密的保護(hù)層，所以乳化活性也隨之發(fā)生變化。Zhu 等試驗(yàn)結(jié)果表明乳液的粒徑越小，則電位絕對(duì)值越大，乳化穩(wěn)定性越高，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。結(jié)果表明，三種多糖-酪蛋白均能夠顯著提升酪蛋白的乳化性質(zhì)，使乳液更穩(wěn)定，其中葡聚糖-酪蛋白的效果更好。

圖5 含有不同濃度多糖的多重乳液的乳化活性Fig.5 Emulsifying activity of multiple emulsions containing different concentrations of polysaccharides

圖6 含有不同濃度多糖的多重乳液的乳化穩(wěn)定性Fig.6 Emulsifying stability of multiple emulsions containing different concentrations of polysaccharides

2.5 多糖-酪蛋白對(duì)W/O/W 型多重乳液SAL 包埋率及載藥量的影響

包埋率和載藥量是評(píng)價(jià)載體對(duì)活性物質(zhì)包埋能力的重要指標(biāo)，優(yōu)異的包埋能力對(duì)活性物質(zhì)的保護(hù)、靶向釋放和生物利用度的提升具有重要意義。由圖7 和圖8 可知，酪蛋白對(duì)照組多重乳液中SAL 的平均包埋率為64.46%，載藥量為116.02±0.12 μg/g，葡聚糖-酪蛋白多重乳液SAL 包埋率及載藥量隨葡聚糖濃度呈先升高后降低的趨勢(shì)，在葡聚糖濃度為1.2%時(shí)包埋率達(dá)到最大值92.8%，載藥量為162.89±4.21 μg/g，顯著高于其他多糖組與酪蛋白對(duì)照組（＜0.05）。Leong 等指出內(nèi)水相滲透壓是外水相10 倍時(shí)多重乳液才能達(dá)到穩(wěn)定。當(dāng)葡聚糖濃度高于1.2%時(shí)滲透壓較低，容易導(dǎo)致內(nèi)水外滲，降低包埋率及載藥量；濃度低于1.2%時(shí)，內(nèi)水相滲透壓過高，引起外水內(nèi)滲，最終使多重乳液液滴破裂，降低包封率及載藥量。殼聚糖-酪蛋白及大豆多糖-酪蛋白多重乳液SAL 包埋率及載藥量提升不明顯，其中殼聚糖-酪蛋白組包埋率介于66.54%～69.58%之間（載藥量介于119.78±3.47～125.25±3.92 μg/g 之間），大豆多糖-酪蛋白包埋率介于65.35%～68.4%之間（載藥量介于117.64±5.75～123.11±2.75 μg/g 之間）。由上文可知，與葡聚糖-酪蛋白組相比，殼聚糖-酪蛋白與大豆多糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑較大，乳液穩(wěn)定性弱于葡聚糖-酪蛋白組，易導(dǎo)致W/O 液滴融合，致使部分SAL 游離至外水相，包埋率降低。綜上表明殼聚糖-酪蛋白與大豆多糖-酪蛋白不能明顯提升多重乳液的包埋能力，而葡聚糖-酪蛋白顯著增加了多重乳液對(duì)SAL 的保護(hù)效果，加強(qiáng)了多重乳液的載藥性能。

圖7 添加不同濃度多糖的多重乳液的包埋率Fig.7 Embedding rate of multiple emulsions with different concentrations of polysaccharides

圖8 添加不同濃度多糖的多重乳液的載藥量Fig.8 Drug loading of multiple emulsions with different concentrations of polysaccharides

2.6 模擬消化中多糖-酪蛋白對(duì)W/O/W 型多重乳液平均粒徑的影響

圖9 顯示，在模擬口腔消化中，葡聚糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑隨葡聚糖濃度增加呈先降低后升高的趨勢(shì)，葡聚糖濃度為1.2%時(shí)平均粒徑達(dá)到最小值621.93±3.58 nm（＜0.05），殼聚糖-酪蛋白與大豆多糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑均與圖2 結(jié)果相近似，平均粒徑與未參加消化時(shí)相差不大。表明此時(shí)多重乳液相對(duì)穩(wěn)定，受-淀粉酶的消化作用影響較小。

圖9 模擬口腔消化中不同多重乳液的平均粒徑Fig.9 Average particle size of different multiple emulsions in simulated oral digestion

如圖10 所示，在模擬胃消化階段中，酪蛋白對(duì)照組多重乳液在胃蛋白酶的消化下結(jié)構(gòu)塌陷使液滴聚集到一起，平均粒徑顯著增加，與模擬口腔消化相比由875.2±2.76 nm 增至1298.9±73.16 nm（＜0.05）。葡聚糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑與模擬口腔時(shí)的平均粒徑相比未發(fā)生顯著變化（＞0.05），且在模擬胃消化時(shí)平均粒徑顯著小于酪蛋白對(duì)照組（＜0.05），可知葡聚糖-酪蛋白多重乳液受胃蛋白酶影響較小。殼聚糖-酪蛋白組與大豆多糖-酪蛋白組在多糖濃度為0.6%～1.5%時(shí)，多重乳液平均粒徑顯著大于葡聚糖-酪蛋白組（＜0.05），說明與葡聚糖相比，殼聚糖與大豆多糖添加量較高時(shí)易導(dǎo)致內(nèi)水外滲，受胃蛋白酶影響多重乳液穩(wěn)定性下降，平均粒徑增大。

圖10 模擬胃消化中不同多重乳液的平均粒徑Fig.10 Average particle size of different multiple emulsions in simulated gastric digestion

由圖11 可得，多重乳液從模擬胃進(jìn)入到模擬腸消化后，酪蛋白對(duì)照組、葡聚糖-酪蛋白、殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白多重乳液平均粒徑與模擬口腔和胃消化時(shí)大幅度降低，介于350.3±23.65 nm 和631.77±31.25 nm 之間，各組多重乳液幾乎被完全消化，三種多糖-酪蛋白對(duì)多重乳液的影響無法判斷，產(chǎn)生的小分子多肽、釋放的SAL 與腸液環(huán)境中的膽鹽等形成類似于膠束的小顆粒，從而使消化液的粒徑變小，W/O 液滴被完全破壞聚集成油滴并被消化成更小的油滴，這與Frank 等的結(jié)果一致。此時(shí)多重乳液中的SAL 釋放到腸道中，發(fā)揮其生理功能。

圖11 模擬腸消化中不同多重乳液的平均粒徑Fig.11 Average particle size of different multiple emulsions in simulated intestinal digestion

綜上結(jié)果表明，口腔消化階段的-淀粉酶對(duì)多重乳液影響較小；在胃消化階段，葡聚糖-酪蛋白多重乳液比殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白組更能夠有效延緩胃蛋白酶對(duì)其的消化，減少此階段對(duì)多重乳液平均粒徑和穩(wěn)定性的影響；在腸消化階段，所有多重乳液受胰酶、脂肪酶及膽鹽的影響均被消化，平均粒徑變小。

2.7 模擬消化中多糖-酪蛋白對(duì)W/O/W 型多重乳液SAL 釋放率的影響

如圖12 所示，經(jīng)口腔消化后，酪蛋白對(duì)照組多重乳液SAL 平均釋放率為36.02%，1.2%葡聚糖-酪蛋白多重乳液SAL 平均釋放率為10.7%，多重乳液微觀結(jié)構(gòu)如圖13 所示，與未參與消化的多重乳液微觀結(jié)構(gòu)中液滴大小和分布無明顯差異，表明-淀粉酶對(duì)多重乳液的結(jié)構(gòu)及包埋率影響較小，此時(shí)釋放的均為未被包埋的游離態(tài)SAL。經(jīng)胃消化后，酪蛋白對(duì)照組多重乳液SAL 平均釋放率為74.28%，多重乳液微觀結(jié)構(gòu)中液滴與模擬口腔消化時(shí)明顯變大，這是由于胃蛋白酶對(duì)酪蛋白的消化，導(dǎo)致多重乳液結(jié)構(gòu)塌陷使液滴聚集到一起，導(dǎo)致SAL 部分釋放。但葡聚糖-酪蛋白多重乳液微觀結(jié)構(gòu)中液滴大小相對(duì)穩(wěn)定，說明葡聚糖和酪蛋白形成的復(fù)合物能夠有效延緩胃蛋白酶對(duì)其的消化，仍能夠起到良好的SAL 保護(hù)作用，Giroux 等也證明W/O/W 型多重乳液能夠在胃消化期間維持乳液微觀形態(tài)穩(wěn)定。在腸消化階段，經(jīng)胰酶和脂肪酶消化后所有多重乳液微觀結(jié)構(gòu)均被破壞，SAL 被釋放，其中葡聚糖添加量為1.2%的葡聚糖-酪蛋白多重乳液的SAL 平均釋放率從32.26%升高到92.4%，SAL 在模擬腸消化階段累計(jì)釋放量達(dá)到60.14%。說明葡聚糖-酪蛋白多重乳液模擬體外消化時(shí)能有效保護(hù)SAL 并控制釋放，且隨葡聚糖濃度的增加，對(duì)SAL 的保護(hù)控釋作用呈先升高后降低的趨勢(shì)，在濃度為1.2%時(shí)達(dá)到最好效果。

圖12 含有不同濃度葡聚糖的多重乳液體外模擬消化SAL 釋放率Fig.12 SAL release rate of simulated digestion in vitro of multiple emulsions containing different concentrations of glucan

圖13 添加葡聚糖的多重乳液在不同模擬消化階段的顯微鏡照片（10×100）Fig.13 Microscopic photographs of multiple emulsions added dextran at different stages of digestion（10×100）

圖14 和圖15 結(jié)果可知，在口腔消化和胃階段，部分殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白多重乳液SAL 釋放率超過酪蛋白對(duì)照組多重乳液，其原因可能是W/O 液滴聚集，導(dǎo)致部分SAL 被釋放，在腸消化階段，殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白仍能夠提供一定的保護(hù)作用，且大豆多糖-酪蛋白效果優(yōu)于殼聚糖-酪蛋白，但兩者效果明顯弱于葡聚糖-酪蛋白，說明外水相乳化劑中的多糖種類和濃度對(duì)消化程度有著明顯的影響。

圖14 含有不同濃度殼聚糖的多重乳液體外模擬消化SAL 釋放率Fig.14 Simulated digestion SAL release rate of multiple emulsions containing different concentrations of chitosan in vitro

圖15 含有不同濃度大豆多糖的多重乳液體外模擬消化SAL 釋放率Fig.15 Simulated digestion SAL release rate of multiple emulsions containing different concentrations of soybean polysaccharides in vitro

本研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖-酪蛋白與大豆多糖-酪蛋白對(duì)SAL 的保護(hù)效果較差，使其過早的在模擬口腔和胃消化過程中滲出，而葡聚糖-酪蛋白多重乳液中的SAL 能被更多的靶向釋放到腸道中，能夠提高SAL的生物利用率，在葡聚糖添加量為1.2%時(shí)，保護(hù)和控釋效果最佳，這與體外消化對(duì)乳液粒徑影響結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本研究采用三種多糖-酪蛋白制備W/O/W 型多重乳液，其中葡聚糖-酪蛋白在提升多重乳液穩(wěn)定性和保護(hù)SAL 方面表現(xiàn)出更好的性能，并擁有較好的乳化性能。在葡聚糖添加量為1.2%時(shí)，葡聚糖-酪蛋白多重乳液的穩(wěn)定性最好，SAL 包埋率最高可達(dá)92.8%，載藥量為162.89±4.21 μg/g，顯著高于殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白（＜0.05）。模擬體外消化過程中，葡聚糖-酪蛋白能夠減少多重乳液受口腔和胃消化的影響，并靶向地在腸道內(nèi)傳遞和釋放SAL，提高SAL 的生物利用率，當(dāng)葡聚糖添加量為1.2%時(shí)，對(duì)多重乳液的保護(hù)和控釋效果最佳，使SAL在腸道內(nèi)釋放率高達(dá)60.14%；殼聚糖-酪蛋白和大豆多糖-酪蛋白多重乳液與葡聚糖-酪蛋白組相比乳液穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致部分SAL 易游離至外水相，包埋率及載藥量降低，在模擬胃腸消化階段，多重乳液雙層結(jié)構(gòu)被破壞，SAL 大量釋放，對(duì)SAL 的保護(hù)效果及生物利用度明顯弱于葡聚糖。

本研究表明，葡聚糖-酪蛋白W/O/W 型多重乳液可以有效保護(hù)并控釋紅景天苷，為紅景天苷在食品與醫(yī)藥中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)支撐。