陽離子淀粉與硒化淀粉混合對淀粉基仿生谷胱甘肽過氧化物酶催化活性的影響

張瑞瑞，石 成，胡漢嬌，鐘書明，鄭韻英，梁興唐，尹艷鎮

（廣西綠色化工新材料與安全技術重點實驗室，北部灣大學石油與化工學院，廣西欽州 535011）

硒是一種微量元素，硒及其化合物雖然都具有一定毒性，但是硒是動植物必需的營養元素。硒在生命化學中的作用依賴于一個獨特的官能團：硒醇基團（-SeH）。谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）以還原性谷胱甘肽（Glutathione，GSH）為底物，催化還原多種過氧化物，進而清除細胞組織中過量的脂質過氧化物和自由基，避免機體受過氧化物損傷。這對于保持生物體正常的生理代謝起著重要的作用，通常將GPx 活性作為衡量硒在人體內功能的指標。GPx對治療和預防克山病、心血管病、炎癥及癌癥等疾病具有很重要的作用。天然GPx 是優秀的生物催化劑，在溫和的條件下具有高效的催化特異性。然而，幾乎所有的天然GPx 都具有蛋白質固有的缺點，包括體外穩定差、來源有限、利用率低、成本高，難以回收和難再生等。近年來，天然GPx 的獨特催化性能激發了許多科學家推動仿生GPx 模擬催化劑的開發。仿生GPx 的研究進展不僅促進了人們對催化機理的認識，也促進了具有潛在醫藥應用前景的仿生GPx 的生產。將硒或碲引入仿生GPx 中已成為人工酶研究的熱點。

淀粉作為可再生的天然高分子材料具有很大的開發前景，本文在前期研究了以木薯淀粉（Cassava Starch，CS）為骨架構建仿生GPx，辛烯基琥珀酸淀粉酯（Starch Octenyl Succinate，OSA-starch）與硒氫化鈉（NaSeH）的親核加成反應為所得硒化淀粉（Selenized Starch，SCS）提供了催化活性位點（-SeH）和疏水微環境，賦予SCS 良好的抗氧化催化活性。同時在SCS 上添加正電荷基團，能夠有效地模擬識別位點，與催化中心有效配合能夠富集底物，對催化活性具有提升作用，但在SCS 上直接修飾陽離子基團所受到的影響因素比較多，很難保證催化中心和正電荷基團達到最佳配合，而且過多的陽離子改性會導致催化活性降低。合成制備具有正電荷基團的陽離子淀粉（Cationic Starch，CCS）與SCS 進行有效地混合，SCS 提供的催化活性位點（-SeH）和疏水微環境與CCS 的正電荷基團實現有效配合，可以提升SCS 的催化活力。同時，陽離子淀粉的制備工藝比較成熟，可以進行大規模的生產，因此本研究采用SCS 與CCS 混合構建類GPx 的催化中心、疏水微環境、識別位點，通過類GPx 的催化活性測試和催化機理分析，表明提升淀粉基仿生谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的催化活力，這些可以為淀粉基仿生GPx 規模化生產應用提供了理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辛烯基琥珀酸酐、無水硫酸銅、硼酸、甲基紅、芘 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、硫酸鉀、氫氧化鈉、硫酸、硝酸、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 西隴科學股份有限公司；硼氫化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；硒粉 天津市大茂化學試劑廠；溴甲酚綠 成都市科隆化學品有限公司；4-硝基苯硫酚 英國Fluorochem 公司；過氧化氫 成都金山化學試劑有限公司；高氯酸 福晨（天津）化學試劑有限公司；2,3-環氧丙基三甲基氯化銨 上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑均為分析純；氮氣（99.99%）廣西瑞達化工科技有限公司；木薯淀粉（工業級）廣西農墾明陽生化集團有限公司；3-羧基-4-硝基苯硫酚（TNB）根據Dong 等報道的方法自制。所有化學試劑無需進一步純化即可使用。

PSB 50-72 石墨消解器 Perkin-Elmer 美國股份有限公司；AFS-9530 原子熒光光度計 北京海光儀器有限公司；Perkin-Elmer Frontier 傅里葉變換紅外光譜儀 美國Perkin-Elmer 股份有限公司；AVANCE III HD 500 MHz 核磁共振波譜儀、D8 ADVANCE X 射線衍射儀 德國布魯克科技公司；Sigma HD 掃描電子顯微鏡 德國蔡司股份公司；UV-2600 紫外可見分光光度計 日本島津公司；TG/DSC 1 熱分析儀 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Agilent Cary Eclipse 熒光分光光度計 美國安捷倫科技有限公司；Zetasizer Nano-ZS 納米粒度及Zeta 電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 硒化木薯淀粉的制備 將135.2 mg 硒粉（Se）和194.3 mg 硼氫化鈉（NaBH）置于三口燒瓶中，通入氮氣10 min 除去體系中的空氣，然后在氮氣氛圍下向燒瓶中加入20 mL 無氧的去離子水。反應在室溫條件下進行30 min，得到硒氫化鈉（NaSeH）溶液。在氮氣氛圍和攪拌的條件下，將上述NaSeH 溶液滴加到含有5.0 g OSA-starch（DS=0.012）和80 mL乙醇的250 mL 燒瓶中。反應在40 ℃下保持6 h。然后在氮氣氛圍下用去離子水和75%乙醇交替洗滌產物，在55 ℃真空干燥24 h 后，獲得SCS（圖1）。

圖1 SCS 的合成Fig.1 Synthesis of SCS

1.2.2 陽離子淀粉的制備 根據任紅銳等、冒愛榮等的實驗方法，將20.0 g 木薯淀粉和100 mL異丙醇水溶液（30%，w/w）配制成乳液，加入1.0 g NaOH 進行活化30 min，將4.0 g 2,3-環氧丙基三甲氯化銨（GTA，基于淀粉樣品質量的25%）溶解于20 mL 去離子水中，并緩慢滴加入淀粉乳液中，滴加完畢以后在40 ℃下攪拌進行反應6 h。反應結束后用HCl 溶液（0.5 mol/L）逐滴加入直至反應液成中性，真空抽濾反應液，然后采用去離子水和75%乙醇交替洗滌產物，最后在55 ℃條件下烘干12 h，即可得到陽離子淀粉（CCS）樣品（圖2）。

圖2 CCS 的合成Fig.2 Synthesis of CCS

1.2.3 核磁共振氫譜分析 CS、SCS 和CCS 的核磁共振氫譜（H NMR）測試在核磁共振儀（Bruker AVANCE III HD 500 MHz）上進行，將干燥后的樣品溶于重水（DO）中，超聲處理5 min，將樣品轉移進入核磁管，然后進行測試。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 CS、SCS 和CCS 的傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測試在傅里葉紅外光譜儀（PerkinElmer Frontier）上進行，干燥的樣品使用衰減全反射（ATR）模式在4000～500 cm的范圍內掃描，掃描次數為32 次，分辨率為4 cm。

1.2.5 X 射線衍射分析 CS、SCS 和CCS 的X 射線衍射（XRD）曲線的測定在X 射線衍射儀（Bruker D8 ADVANCE）上進行。掃描條件為電壓為40 kV，電流為40 mA，衍射角（2）的掃描范圍為5～50°，步寬為0.05°。在測定之前，樣品在50 ℃下平衡24 h。根據Frost 等先前報道的方法定量估計樣品的相對結晶度，即結晶域面積（衍射峰的面積）與XRD 總面積之比。

1.2.6 熱失重測定 CS、SCS 和CCS 的熱重分析在同步熱分析儀（Mettler-Toledo TGA/DSC1）上進行，干燥的樣品（10 mg 左右）在氮氣條件下（20 mL/min）進行升溫測定，溫度范圍為30～600 ℃，加熱速率為10 ℃/min。

1.2.7 掃描電子顯微鏡分析 CS、SCS 和CCS 的形貌檢測在掃描電子顯微鏡（Zeiss Sigma HD）上進行，將干燥后的樣品輕薄且均勻的涂抹在樣品臺上的導電膠上，隨后進行噴金處理，在加速電壓5.0 kV 條件下進行掃描，拍攝具有代表性的形貌圖片。

1.2.8 SCS 與CCS 的混合 稱取0.5 g 的SCS，根據正電荷基團與催化中心不同的比例，即氮與硒的摩爾比（n（N）/n（Se））為100、300、600、1200、2000、3000、6000，添加不同質量的CCS（7.194、21.58、43.16、86.32、215.8、431.6 g）與SCS 進行充分的研磨混合，記為SCS/CCS。

1.2.10 CCS 中氮含量的測定 0.5 g CCS 樣品、0.5 g無水硫酸銅（CuSO）和4.5 g 硫酸鉀（KSO）加入到50 mL 錐形瓶中，然后加入10 mL 濃HSO，蓋上彎頸漏斗搖勻后拿去加熱板上進行消解處理。分別在180、240、400 ℃消解60 min，然后冷卻至室溫待測。加入10 mL 去離子水將消解后的樣品轉移至凱氏定氮管中并放置于凱氏定氮儀中，樣品中的氨在蒸氣的作用下被蒸餾出來，被硼酸溶液所吸收，顏色由紫紅色變為綠色。最后用硫酸溶液（0.5 mol/L）進行滴定，滴定終點是綠色變為淡紅色。同時，做空白實驗，樣品氮含量根據下式計算：

式中，X 為淀粉樣品的氮含量（%）；c 為HSO溶液的濃度（mol/L）；V為淀粉樣品滴定消耗硫酸的體積（mL）；V為空白滴定消耗硫酸的體積（mL）；m 為淀粉樣品的質量（g）；1.401 為氮的相對原子質量/10（g/mol）。每個測試樣品做3 個平行實驗，取平均值。CCS 樣品的氮含量為0.136%。

1.2.11 催化活性的測定 根據Wu 等報道的方法測定GPx 的催化活性，即使用苯硫酚（ArSH）和氫過氧化物（ROOH）作為底物在紫外-可見分光光度計上進行測定。首先，將700 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.0，50 mmol/L）、100 μL 淀粉樣品分散液和100 μL ArSH 底物溶液（4-硝基苯硫酚（NBT）或3-羧基-4 硝基苯硫酚（TNB），1.5 mmol/L）加入石英比色皿（1 mL，L=1 cm）中。石英比色皿中的混合物在室溫下在超聲下孵育1 min。通過添加100 μL ROOH（枯烯過氧化氫（CUOOH）或過氧化氫（HO），2.5 mmol/L）啟動酶促反應。在紫外-可見分光光度計上監測410 nm吸光度的變化（ΔA）。使用上述相同方法進行對照測試，但淀粉樣品分散液被100 μL PBS 代替。酶促反應的初始反應速率（v，μmol/(L·min)），即GPx 的催化活性，由下式計算：

式中，ΔA 為淀粉樣品和對照組之間在410 nm處的吸光度變化；為ArSH 底物的摩爾消光系數（=14600 L/mol·cm，=13600 L/mol·cm，pH=7.0）；L 為石英比色皿的光程（cm）；Δt 為410 nm 處吸光度變化的時間差（min）。所有樣品測定3 次，取平均值。

1.2.12 催化活性的分析 根據Wu 等建立評估天然GPx 和仿生GPx 的催化活性的方法，以初始速率（v，（μmol/L）/min）作為抗氧化催化活性的指標。在測定v的過程中扣除了ArSH 的自氧化速率，使用一個分子催化中心（-SeH）作為酶的催化中心來計算活性，以ArSH 底物和氫過氧化物（ROOH）底物為雙重底物，測量SCS、CCS、SCS/CCS 和GTA/SCS的抗氧化催化活性（v，（μmol/L）/min）。此外，其他酶學參數根據Michaelis-Menten 方程（式3）和雙倒數圖（式4）確定。

式中，K是米氏常數（μmol/L），[S]是底物的濃度（μmol/L），v表示最大反應速率（μmol/（L·min））。

[E]是酶的初始濃度（μmol/L），反應常數（K，1/min）可以根據以下式進行計算：

1.2.13 疏水性測定 采用芘熒光探針法分析SCS、CCS 和SCS/CCS 樣品的疏水性。芘采用甲醇配制成1×10mol/L 的芘儲備液。100 μL 的儲備溶液添加比色管中，然后在除去甲醇后分別添加10 mL 的淀粉樣品分散液（2% w/V），室溫下超聲處理20 min。熒光光譜測定在熒光分光度計（Agilent Cary Eclipse）中進行，熒光激發波長為334 nm，激發狹縫寬度為5 nm，發射狹縫寬度為2.5 nm，發射波長范圍為350～500 nm。每個樣品做3 個平行，取平均值。采用λ=372 nm 處峰與λ=383 nm 處峰的強度比（I/I）評價疏水性。

1.2.14 Zeta 電位分析 不同氮與硒物質的量比的SCS/CCS 樣品Zeta 電位的測定在納米粒度及Zeta電位分析儀（Zetasizer Nano-ZS）進行，樣品分別采用去離子水配制成分散液（1% w/V），室溫下超聲處理20 min，然后將上述分散液分別加入樣品池中，在25 ℃下測定樣品的Zeta 電位，每個樣品做3 個平行，取平均值。

1.3 數據處理

數據結果以平均值±標準差表示，采用Origin 2018 64Bit 制圖。

2 結果與分析

2.1 1H NMR 分析

CS、SCS 和CCS 的H NMR 譜圖如圖3 所示。信號峰在約5.46 ppm（a）和3.5～4.3 ppm（b）主要來源于淀粉糖單元骨架上亞甲基氫（-CH-）和次甲基氫（-CH-），出現在CS 的H NMR 光譜中。與CS 相比，c 信號峰代表的是酯化改性OSA 上雙鍵以外氫的信號峰。在SCS 的H NMR 譜中，a 和b 信號峰仍然存在，表明在硒化和酯化改性過程中保留了CS 的主要骨架結構。對比CS 的核磁譜圖，CCS譜圖中b 信號峰的強度較弱，主要是淀粉骨架上活化的羥基與陽離子醚化劑發生了陽離子醚化改性反應。CCS 的譜圖上在化學位移3.22 ppm（d）處一個額外的信號峰，這歸因于季銨基（CH）N上的質子氫，季銨基基團特征峰的出現表明，CS 上成功改性了陽離子基團，氮含量的測定也同時印證了這一觀點。

圖3 CS、SCS 和CCS 的1H NMRFig.3 1H NMR spectra of CS,SCS and CCS

2.2 FT-IR 分析

CS、SCS 和CCS 的FT-IR 光譜如圖4 所示。所有特征峰均根據報道的文獻進行分配。在CS 的FT-IR 光譜中：3300 cm左右的較寬的峰信號主要是由于-OH 伸縮振動引起；1639 cm左右出現的峰信號峰源于淀粉中結合水的吸收振動。與CS 的FT-IR 光譜圖相比，SCS 的FT-IR 光譜顯示出與CS 基本相同的信號峰，表明淀粉的分子骨架在改性過程中是穩定的。同時，3300 cm的-OH 拉伸強度和1639 cm處結合水振動強度降低，這些結果表明SCS 的合成制備過程消耗了淀粉骨架上的羥基，并且在改性過程中可能產生了疏水特性導致結合水的減少。與木薯的FT-IR 光譜圖相比，CCS 在1483 cm處表現出新的信號峰，這個特征信號峰可歸因于季銨基C-N 拉伸振動，這就是陽離子基團與淀粉主鏈結合的證據。同時，在1238 cm處C-O-C 的特征峰信號強度有所增強，這些證據表明在CS 骨架上成功改性了陽離子基團，這個結果與H NMR 分析結果一致。CCS 的FT-IR 光譜顯示出與CS 基本相同的吸收峰，表明在陽離子醚化改性過程中淀粉的分子骨架沒有發生改變，具有穩定性。

圖4 CS、SCS 和CCS 的FT-IR 光譜Fig.4 FT-IR spectra of CS,SCS and CCS

2.3 XRD 分析

X 射線衍射技術是一種重要的結構測試手段，可以檢測淀粉樣品的晶體結構變化，進而分析淀粉樣品的結構穩定性變化。CS、SCS 和CCS 的X 射線衍射曲線如圖5 所示。所有樣品均顯示出典型的A型結構，即在15°、17°、18°和23°處出現衍射峰，改性過程并未破壞淀粉的主體晶體結構。與CS 的結晶度（44.1%）相比，SCS 的結晶度降低到38.1%。由于硒化改性只在OSA 鏈上發生親核加成，不影響淀粉的結晶度，結晶度的輕度降低可能是強堿性環境引起的。CCS 的XRD 衍射峰與CS 基本上一致，結晶度降低到38.6%，陽離子醚化改性也是在堿性條件下進行，這些可能是強堿性的反應環境影響的結果。總體而言，SCS 和CCS 保持淀粉結構的穩定性，堿性反應條件的腐蝕使結晶度有所降低。

圖5 CS、SCS 和CCS 的XRD 曲線Fig.5 XRD curves of CS,SCS and CCS

2.4 熱重（TG &DTG）分析

TG 是一種常用的材料結構分析技術，根據溫度來改變樣品的重量，并評估其熱穩定性。CS、SCS和CCS 的TG 曲線和相應的差熱分析（DTG）曲線分別如圖6A 和圖6B 所示。所有淀粉樣品的熱分解在TG 曲線中主要分為兩個階段。第一階段是物理脫水引起的失重，第二階段是淀粉聚合物鏈的熱分解引起的失重。如圖6A 所示，在150 ℃之前，發生了第一階段失重，SCS、CCS 和CS 的物理脫水重量損失分別為6.9%、8.2%和9.5%。與CS 相比，SCS表現出較低的失重，這可能是由于疏水性的OSA 鏈錨定在淀粉顆粒表面以抑制其吸水率。對于CCS，陽離子醚化反應是在堿-醇混合物中進行的，這可以使淀粉脫水。對于這些結果與相關樣品在2800～3500 cm處峰強度的降低一致（圖4）。SCS、CCS和CS 在第二階段失重終止溫度基本相同，但SCS和CCS 在第二階段失重起始溫度分別為234 ℃和240 ℃，低于CS 失重溫度（262 ℃），這可能是由于含功能基團的短鏈分子如OSA 和GTA 及其與淀粉的鍵合相比規整的淀粉分子更容易分解所致。如圖6B 所示，SCS 和CCS 聚合物鏈分解的DTG 峰分別位于約300 ℃和305 ℃，即SCS 和CCS 最大失重速率溫度分別為300 ℃和305 ℃，低于木薯淀粉的最大失重速率溫度（315 ℃）。這可能是由于改性輕微腐蝕了淀粉顆粒表面，有利于傳熱，從而加速了聚合物鏈的分解。

圖6 CS、SCS 和CCS 的TG（A）和DTG（B）曲線Fig.6 TG (A) and DTG (B)curves of CS,SCS and CCS

2.5 SEM 分析

CS（A1，A2）、SCS（B1，B2）和CCS（C1，C2）的SEM 圖像如圖7 所示。粒徑在3～10 μm 范圍內的木薯淀粉顯示出具有光滑表面的球狀或半球形結構。SCS 保留了淀粉的顆粒結構，但表面粗糙。該表面可能是由于強堿性NaSeH 溶液的侵蝕和錨定的OSA 鏈和一些游離淀粉鏈在制備過程中的聚集所致。也就是說，大部分催化活性位點（-SeH）錨定在淀粉顆粒表面，這將有利于活性位點的暴露以進行催化反應。CCS 的淀粉結構比較完整，形貌的改變主要發生在淀粉顆粒表面，部分淀粉顆粒表面發生類似“剝皮”的現象，這些形貌的改變表明陽離子化醚化改性發生在淀粉顆粒表面，CCS 表面改性的陽離子基團能夠識別催化底物，聚集催化底物與SCS 表面上修飾的催化中心配合促進催化反應的進行。

圖7 CS（A1，A2）、SCS（B1，B2）和CCS（C1，C2）的SEM 圖Fig.7 SEM images of CS (A1,A2),SCS (B1,B2)and CCS (C1,C2)

2.6 催化活性分析

根據Wu 等建立評估天然GPx 和仿生GPx的催化活性的方法，以初始速率（v，μmol/（L·min））作為催化活性的指標。在測定v的過程中扣除了CCS 及GTA 自身的催化速率。使用一個分子催化活性中心（-SeH）作為酶的催化中心來計算活性。

為了研究CCS 上正電荷基團與SCS 的催化中心不同比例配合在四個不同體系對催化活力的影響，將測定過程中ArSH 和ROOH 的濃度分別設置為150 μmol/L 和250 μmol/L。圖8 顯示了25 ℃、pH7.0（50 mmol/L PBS）條件下，不同比例的正電荷基團與催化中心的SCS/CCS 催化ArSH 還原ROOH 的v。在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中，SCS/CCS 的v隨著氮元素物質的量比硒元素物質的量比（n（N）/n（Se））的增加呈現出相似的變化趨勢，即v隨著n（N）/n（Se）的增加先增加而后逐步減低。當n（N）/n（Se）為1200 時，與SCS 相比，在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中的催化活力分別提升了22.1%、25.8%、17.5%、19.6%。這可能是CCS上的正電荷基團增加了底物識別位點，識別位點使底物富集在CCS 表面周圍，隨著布朗運動的作用，CCS 碰撞靠近SCS 表面上的催化中心，底物與催化中心充分接觸，進而提高反應催化活性。當n（N）/n（Se）超過1200 左右時，CCS 表面分子鏈與底物形成較強的結合力，底物會附著在CCS 表面周圍很難釋放，使SCS 表面上的催化中心很難接觸到底物，進而使催化活性降低。SCS/CCS 在n（N）/n（Se）為1200 具有最佳的催化活性。

圖8 SCS/CCS 催化ArSH（150 μmol/L）與ROOH（250 μmol/L）反應的初始速率（v0）Fig.8 Initial rate (v0) of the reaction between ArSH(150 μmol/L) and ROOH (250 μmol/L) catalyzed by SCS/CCS at different systems

由于CCS 顆粒大小與SCS 相當，與催化中心碰撞接觸過程會有一定的空間位阻，需要富集更多的底物才能和催化中心進行配合達到提高催化活性的效果。進一步探索具有較小位阻的小分子陽離子基團對催化活性的影響。在SCS 分散液添加不同比例GTA（n（N）/n（Se）為100、300、600、900、1200、1500、2000，記為GTA/SCS）進行測試催化活性，圖9 顯示了在25 ℃、pH7.0（50 mmol/L PBS）條件下，不同比例的GTA 與催化中心的GTA/SCS 催化ArSH 還原ROOH 的v。GTA/SCS 的催化活力在隨著n（N）/n（Se）的變化呈現出相似的規律，即當n（N）/n（Se）小于900 左右時，催化活力隨n（N）/n（Se）逐漸增加；然而，當n（N）/n（Se）的比例進一步增加會導致催化活力的降低。與SCS 相比，在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中的最大催化活力分別提升了15.8%、29.8%、21.2%、31.6%，這可能是GTA 識別效應對底物具有聚集作用，進而接觸催化中心提高催化效率，提升催化活力。同時過多添加GTA，產生較強的識別作用可能會抑制反應底物的釋放，從而阻礙下一個催化循環，進而導致較低的催化活性。

圖9 GTA/SCS 催化ArSH（150 μmol/L）與ROOH（250 μmol/L）反應的初始速率（v0）Fig.9 Initial rate (v0) of the reaction between ArSH(150 μmol/L) and ROOH (250 μmol/L) catalyzed by GTA/SCS at different systems

圖10 顯示了SCS/CCS 和GTA/SCS 催化ArSH還原ROOH 的v隨時間變化關系。GTA/SCS 的催化活力在隨著時間的變化呈現出相似的規律，隨著時間的增加催化活力逐步減低，這可能是GTA 在SCS的分散液中不能穩定存在，其識別位點的作用不能穩定，對催化效果隨著時間的變化具有不穩定性。SCS/CCS 的催化活性基本保持一致，這是由于正電荷基團錨定在淀粉顆粒表面，能夠穩定存在，可以保證催化活性的穩定一致性。后續的催化機理研究采用n（N）/n（Se）為1200 時的SCS/CCS。

圖10 SCS/CCS 和GTA/SCS 催化ArSH（150 μmol/L）與ROOH（250 μmol/L）反應的初始速率比較Fig.10 Comparison of the initial rates (v0) for the reaction of ArSH (150 μmol/L) and ROOH (250 μmol/L) catalyzed by SCS/CCS and GTA/SCS at different systems

為了進一步研究催化行為，將TNB 或NBT 的濃度固定為150 μmol/L，測試了SCS/CCS 在不同濃度ROOH（CUOOH 或HO）的不同反應體系中的v。如圖11 所示，在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO四個體系中，SCS/CCS的v隨著ROOH（CUOOH 或HO）濃度的增加呈現出相似的變化趨勢，即v隨著ROOH 濃度的增加而增加，然后達到了平衡。四個體系中SCS/CCS 的v相對于ROOH 濃度的曲線類似于天然GPx 的催化行為，顯示出典型的飽和動力學行為。

圖11 在ArSH（150 μmol/L）下SCS/CCS 催化反應初始速率隨ROOH 濃度的變化曲線Fig.11 Profiles of initial rate against the concentration of ROOH at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentration of ArSH at 150 μmol/L

2.7 催化機制分析

每個Se 單體對應的v的倒數（[E]/v）與ROOH濃度的倒數（1/[CUOOH]或1/[HO]）做雙倒數曲線，即Lineweaver-Burk 圖。如圖12 所示，在TNB或NBT 濃度不變的情況下，它們在不同濃度的ArSH 下相互平行，表明SCS/CCS 對ArSH 和ROOH反應的催化機制均為與天然GPx 相似的“乒乓”催化機制。選擇ArSH 濃度為150 μmol/L 的實驗數據擬合到乒乓動力學機制中，其中最大反應速率（v，μmol/（L·min））、反應常數（K，1/min）、米氏常數（K，μmol/L）和催化效率（K/K，L/mol·min）等催化反應的動力學常數如表1 所示。

圖12 不同濃度ArSH（75、120 和150 μmol/L）下SCS/CCS 的催化速率與ROOH 濃度的雙倒數曲線Fig.12 Profiles of [E]0/v0 against 1/[ROOH] at different reactions catalyzed by SCS/CCS with concentrations of ArSH at 75,120 and 150 μmol/L

一般情況下，K代表反應速率為最大反應速率一半時底物的濃度，反映底物與酶的結合強度，K越低，仿生GPx 材料與底物之間的結合力越強，而K/K值越大意味著仿生GPx 材料的催化效率越高。如表1 所示，在NBT 和TNB 的兩種反應體系中，K（CUOOH）的值都小于K（HO）的值，表明底物HO與CUOOH 相比，SCS/CCS 對底物CUOOH 的親和力更高。此外，SCS/CCS 在催化CUOOH 和ArSH 反應時顯示出更高的v和K/K，表明SCS/CCS 催化ArSH 還原CUOOH 的反應效率高于HO。在這些反應體系中，ROOH（CUOOH 和HO）是唯一的區別。因此，ROOH 的結構差異可能是動力學常數變化的主要原因。由于對異丙苯基的存在，CUOOH 比HO更疏水，并且在SCS/CCS的催化下表現出更高的還原能力。因此，可以得出結論，SCS/CCS 更適合捕獲催化反應的疏水底物。

表1 SCS/CCS 催化反應的動力學常數Table 1 The kinetic parameters of catalytic reactions of SCS/CCS

由于不存在羧基，NBT 與TNB 相比顯示出更高的疏水性。然而，與其他組合相比，TNB 和CUOOH的底物組合顯示出最低的K和最大的K/K，這些結果表明，TNB 和CUOOH 具有更強底物結合能力，源于TNB 中的羧基與識別位點的正電荷基團存在氫鍵作用，更容易富集底物，進而提高催化效率。但是，TNB 和CUOOH 體系中的v略小于NBT和CUOOH 體系（圖9）。一方面，SCS/CCS 能夠容易捕捉疏水性底物CUOOH，另一方面，CCS 表面分子鏈段上正電基團與底物TNB 之間的氫鍵產生的底物識別效應對底物起聚集作用，但是SCS 表面催化中心和底物有一定空間位阻，不能有效進行催化，進而導致TNB 和CUOOH 體系中SCS/CCS 催化反應的v有所降低。

根據先前報道的文獻，GPx 模擬物中的疏水微環境和活性位點在提供高催化活性方面起著重要作用。SCS 表面的疏水性OSA 鏈可以通過疏水相互作用聚集疏水性底物提供了疏水性微環境，這將有利于催化反應。而SCS/CCS 中的疏水微環境增強了催化活性。為了證明SCS/CCS 中疏水微環境的形成，使用芘熒光探針法進行測試。

芘是一種用于測試材料的疏水性常用的熒光探針，λ=372 nm 處的峰和λ=383 nm 處的峰的熒光強度之比（I/I）越小，材料的疏水性越強。芘在木薯淀粉、SCS 和SCS/CCS 分散液中和芘的水溶液的熒光光譜如圖13 所示，測試中芘濃度為5×10mol/L。芘/SCS 的I/I值為1.51，小于芘/CS 的I/I值（1.72），表明在SCS 上形成了疏水性微環境。可能的解釋是淀粉分子鏈段和OSA 鏈的聚集導致表面粗糙，從而增加了其疏水性。芘/（SCS/CCS）的I/I值（1.50）與芘/SCS 的值基本一致，CCS 的添加沒有破壞體系疏水性微環境。SCS/CCS 可以提供催化活性位點（-SeH）和疏水微環境，賦予混合淀粉良好的抗氧化性能。

圖13 芘在SCS（a）、SCS/CCS（b）、CS（d）分散液中和水中（c）的熒光光譜Fig.13 Fluorescence spectra of pyrene in the dispersion of SCS(a),SCS/CCS (b),cassava starch (d) and water (c)

前期研究表明，正電荷基團是能夠高效率地模擬天然GPx 中精氨酸識別位點的官能團。如圖14所示，隨著n（N）/n（Se）的增加SCS/CCS 表面的Zeta電位也增加。隨著大量的CCS 的添加，最后SCS/CCS表面的Zeta 電位呈現電正性，可以模擬識別位點。SCS/CCS 在表面的Zeta 電位約為5.6 mV 時，達到催化效果最優。較低的Zeta 電位達到最優催化效果，這是SCS/CCS 混合體系中識別位點與催化中心存在空間位阻導致的。CCS 表面正電荷越多越容易富集底物，而使底物難以釋放，不易與SCS 表面的催化中心接觸時進行反應，因此SCS/CCS 混合體系中達到最優的催化活力需要較低的正電荷分布，即較低的Zeta 電位。

圖14 不同氮與硒物質的量比的SCS/CCS 的Zeta 電位Fig.14 Zeta potential of SCS/CCS with different molar ratios of nitrogen and selenium

綜上所述，SCS 和CCS 組成的SCS/CCS 混合體系中，SCS 提供的催化中心和CCS 表面的底物識別位點有效配合，形成有利于結合底物的疏水微環境。SCS/CCS 混合體系中底物識別位點對提升催化活力具有貢獻作用，而過強的底物識別位點結合作用會降低催化活力。GPx 催化中心與疏水微環境、底物識別位點的有效匹配是維持SCS/CCS 的高催化活力重要因素。

3 結論

以CS 為原料，分別制備了SCS 和CCS。將兩種淀粉混合可實現目標淀粉中同時含有硒氫基、季銨基和疏水性的辛烯基琥珀酸酯分子鏈，而此三者可模擬谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的三核心要素：含硒催化活性中心、荷正電的識別位點和疏水微環境。當混合淀粉中的氮和硒物質的量比為1200 時，SCS/CCS 的Zeta 電位約為5.6 mV，其在TNB+CUOOH、TNB+HO、NBT+CUOOH、NBT+HO反應體系中的GPx 催化活力分別為13.94、11.25、12.91 和10.87 μmol/min，比SCS 的催化活力分別提高了22.1%、25.8%、17.5%和19.6%。本工作為高催化活性的淀粉基仿生GPx 規模化生產提供了一種簡單的方法。