硫酸軟骨素鈉質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)及關(guān)鍵控制點研究進(jìn)展

趙 琳，姜 雨，蘭 韜，吳 琦，張夢妍，尹秀文，劉洪宇,，云振宇,

（1.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院農(nóng)業(yè)食品標(biāo)準(zhǔn)化研究所，北京 100191；2.國家市場監(jiān)督管理總局食品審評中心，北京 100160）

硫酸軟骨素鈉是動物軟骨組織中提取制得的硫酸化鏈狀糖胺聚糖鈉鹽，主要由不同位置硫酸化的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1→3 糖苷鍵連接，二糖單位以1→4 糖苷鍵連接而成的生物大分子。根據(jù)硫酸基位置和數(shù)量的不同，硫酸軟骨素鈉可以細(xì)分為A、B、C、D、E 等不同的類型。目前國內(nèi)外商品化的硫酸軟骨素鈉多來自豬、雞、牛、羊、鯊魚、魷魚等動物軟骨組織，經(jīng)軟骨降解、核心蛋白水解、去蛋白、回收、純化等過程制得。

硫酸軟骨素鈉主要作為一種緩解骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）癥狀的慢作用藥物（symptomatic slow acting drugs for osteoarthritis，SYSADOA），在長期治療中有緩解疼痛癥狀、改善關(guān)節(jié)功能、延緩病程進(jìn)展的作用。口服硫酸軟骨素鈉的隨機(jī)對照臨床試驗已證實，硫酸軟骨素鈉能夠減輕骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛，降低炎癥標(biāo)志物水平，改善關(guān)節(jié)功能、減少關(guān)節(jié)腫脹和積液，阻止關(guān)節(jié)間隙狹窄，而且作用溫和，不良反應(yīng)小。美國FDA 認(rèn)定硫酸軟骨素鈉為膳食補(bǔ)充劑，主要用于緩解關(guān)節(jié)不適癥狀及保護(hù)軟骨組織。在歐洲、澳大利亞等地區(qū)，硫酸軟骨素鈉被劃分為輔助防治骨關(guān)節(jié)炎藥品范疇，在我國，硫酸軟骨素鈉作為藥品、保健食品已有多年的安全使用歷史。中國是畜牧業(yè)大國，豬、牛、羊等飼養(yǎng)量、屠宰量都居世界首位，憑借資源優(yōu)勢，已是世界上最大的硫酸軟骨素鈉生產(chǎn)國和出口國。

硫酸軟骨素鈉作為從動物軟骨組織中提取的天然酸性黏多糖，其結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)特征、生理活性會因動物種類、組織、提取工藝的不同而存在差異。商品化的硫酸軟骨素鈉又因其純度等級差異、污染物的存在、生物效應(yīng)有限等問題，使得硫酸軟骨素鈉的質(zhì)量控制顯得格外重要。本文通過對比中國、美國、日本、歐洲等國家區(qū)域藥典收載的硫酸軟骨素鈉原料標(biāo)準(zhǔn)，分析現(xiàn)階段硫酸軟骨素鈉質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展現(xiàn)狀，進(jìn)而提煉影響硫酸軟骨素鈉質(zhì)量安全的關(guān)鍵控制點并進(jìn)行深入分析與探討，以期為硫酸軟骨素鈉質(zhì)量安全控制體系的完善提供參考。

1 各國藥典標(biāo)準(zhǔn)比較

藥典作為各國家藥品生產(chǎn)、供應(yīng)、使用和管理的法定技術(shù)依據(jù)，對保證藥品質(zhì)量和安全具有十分重要的作用。從動物軟骨中提取制備的硫酸軟骨素鈉原料已被美國（USP43）、歐洲（EP.10.0）、日本（日本藥局方外醫(yī)藥品規(guī)格）、中國（《中國藥典2020 版》）等國家最新版本的藥典收錄，其標(biāo)準(zhǔn)的比較見表1。

表1 不同國家藥典收錄硫酸軟骨素鈉標(biāo)準(zhǔn)的比對Table 1 Comparison of chondroitin sulfate sodium standards in different pharmacopoeia

1.1 USP43

USP43 分別對陸地動物來源（牛、豬和禽類）和鯊魚來源的硫酸軟骨素鈉做了規(guī)定，內(nèi)容包括定義、鑒別、成分、雜質(zhì)、污染物、特定測試和附加要求七個部分。USP43 在硫酸軟骨素鈉的定義中直接規(guī)定了硫酸軟骨素鈉干燥后含量應(yīng)在90.0%至105.0%。陸地動物來源的硫酸軟骨素鈉結(jié)構(gòu)上應(yīng)以4 位硫酸化二糖為主，鯊魚來源應(yīng)以6 位硫酸化二糖為主，且含有不少于8%的2,6 位硫酸化二糖。USP43 提供了紅外光譜、鈉鹽反應(yīng)、二糖組成分析、比旋光度四種鑒別方法，采用氯化十六烷基吡啶（CPC）滴定法測定含量。USP43 在雜質(zhì)上對熾灼殘渣、氯化物、硫酸鹽、電泳純度、蛋白質(zhì)等5 項指標(biāo)做了限定。污染物要求細(xì)菌總數(shù)不超過10CFU/g、霉菌和酵母總數(shù)不超過10CFU/g，不得檢出沙門氏菌與大腸桿菌。特定測試部分主要規(guī)定了非特定二糖限度、溶液澄清度與顏色、比旋度、pH 和干燥失重等。相比陸地動物來源的硫酸軟骨素鈉，USP43 鯊魚來源標(biāo)準(zhǔn)的區(qū)別主要體現(xiàn)在二糖成分和比旋度限定的差異。

1.2 EP10.0

EP10.0 中規(guī)定的硫酸軟骨素鈉來源為符合人類食用要求的陸地或海洋動物的軟骨，含量應(yīng)在95.0%至105.0%，提供了紅外光譜、鈉鹽反應(yīng)、電泳三種鑒別方法。EP10.0 在硫酸軟骨素鈉雜質(zhì)方面對氯化物、電泳純度、蛋白質(zhì)等3 項指標(biāo)做了限定，EP10.0規(guī)定蛋白質(zhì)含量不高于3.0%，比USP43 規(guī)定的不高于6.0%嚴(yán)格。污染物要求細(xì)菌總數(shù)不超過10CFU/g、霉菌總數(shù)不超過10CFU/g，不得檢出金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌和膽汁耐受革蘭氏陰性菌等，相比USP43 略嚴(yán)格。EP10.0 增加了特性粘度的要求，并通過比旋度來區(qū)分陸地動物來源和海洋動物來源的硫酸軟骨素鈉。

1.3 日本藥局外方醫(yī)藥品規(guī)格

《日本藥局外方醫(yī)藥品規(guī)格》規(guī)定硫酸軟骨素鈉應(yīng)為哺乳動物或魚類的軟骨提取制得，經(jīng)干燥后定量應(yīng)含氮2.5%～3.8%和硫5.5%～7.0%。標(biāo)準(zhǔn)提供了顯色反應(yīng)、硫酸鹽定性、鈉鹽反應(yīng)三種鑒別方法，規(guī)定了熾灼殘渣、氯化物、硫酸鹽等3 項雜質(zhì)限量，未對微生物限量做出規(guī)定，重金屬含量（以鉛計）小于等于20 ppm，砷含量小于等于2 ppm。標(biāo)準(zhǔn)并未給出區(qū)分哺乳動物或魚類來源的硫酸軟骨素鈉的方法或指標(biāo)。

1.4 中國藥典2020 版

中國藥典2020 版收載了硫酸軟骨素鈉原料和硫酸軟骨素鈉片、硫酸軟骨素鈉膠囊兩種制劑，規(guī)定了硫酸軟骨素鈉系自豬的喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織中提取制得的硫酸化鏈狀黏多糖鈉鹽，比旋度為-25.0°～-32.0°；提供了液相色譜、紅外光譜、鈉鹽反應(yīng)三種鑒別方法，并要求對含氮量、pH、氯化物、硫酸鹽、殘留溶劑、干燥失重、熾灼殘渣、重金屬等項目進(jìn)行檢查；硫酸軟骨素鈉含量測定方法為高效液相色譜法（通則0512），應(yīng)為90.0%～105.0%。

1.5 對比分析

對比中國藥典2020 版、USP43、EP10.0、日本藥局外方醫(yī)藥品規(guī)格，EP10.0 和日本藥局外方醫(yī)藥品規(guī)格中規(guī)定的硫酸軟骨素鈉的來源均為多種動物，即陸地或海洋來源的動物的軟骨。USP43 將鯊魚軟骨來源的硫酸軟骨素鈉做了單獨的規(guī)定，但與牛、豬或禽類來源的質(zhì)控項目和限度并無太大區(qū)別。我國藥典中規(guī)定的來源是一種，即豬的喉骨、鼻中骨、氣管等軟骨組織中提取，與其他國家的質(zhì)量安全標(biāo)準(zhǔn)相比，具有特殊性。因不同來源的硫酸軟骨素鈉的二糖單元所占比例、電荷密度、4S/6S 比值和相對分子量不同，故我國藥典中規(guī)定質(zhì)控項目和限度與其他國家藥典存在一定差異。由于USP43 和EP10.0 規(guī)定的硫酸軟骨素鈉來源多樣，針對硫酸軟骨素鈉的含量測定均采用了CPC 滴定法。該方法影響因素少，便于操作，但專屬性較差。中國藥典2020 版只規(guī)定了豬來源，采用的是酶解-高效液相色譜法測定硫酸軟骨素鈉的含量。日本的標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了硫酸軟骨素鈉的含氮量與含硫量。除了規(guī)定常規(guī)的雜質(zhì)限量外，USP43 和EP10.0 需電泳法測定硫酸軟骨素鈉的純度，要求任何單個雜質(zhì)不得超過2%。中國藥典2020版與日本標(biāo)準(zhǔn)則是通過含氮量來進(jìn)一步反映產(chǎn)品純度。雖然硫酸軟骨素鈉含氮，但比一般蛋白質(zhì)的平均氮含量要低得多，因此氮含量也是控制硫酸軟骨素鈉純度的一個重要指標(biāo)。中國藥典2020 版與日本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了重金屬含量，未限定微生物，而USP43 和EP10.0 對微生物進(jìn)行了限定，未對重金屬做要求。中國藥典需要在硫酸軟骨素鈉來源廣泛性和安全指標(biāo)上進(jìn)行完善改進(jìn)。

目前，我國的硫酸軟骨素鈉標(biāo)準(zhǔn)體系中，除了中國藥典收載的口服用硫酸軟骨素鈉、硫酸軟骨素鈉片和硫酸軟骨素鈉膠囊，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)第九冊收載了硫酸軟骨素滴眼液和硫酸軟骨素鈉注射液，規(guī)范了性狀、鑒別、檢查、含量測定等基本要素，指標(biāo)要求均低于中國藥典2020 版收載的口服用硫酸軟骨素鈉標(biāo)準(zhǔn)。我國還有1 項硫酸軟骨素鈉的含量測定方法國家標(biāo)準(zhǔn)和1 項硫酸軟骨素用原料的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。國家標(biāo)準(zhǔn)《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定 液相色譜法（GB/T 20365-2006）》規(guī)定了液相色譜法測定從牛、豬和鯊魚等動物軟骨組織中提取的硫酸軟骨素鈉和鹽酸氨基葡萄糖含量的方法。農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《硫酸軟骨素用原料（NY/T 3906-2021）》對提取硫酸軟骨素的畜禽骨原料進(jìn)行了規(guī)范。

此外，通過調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，我國保健食品領(lǐng)域?qū)嶋H使用的硫酸軟骨素鈉原料來源多樣，多數(shù)無法按照中國藥典的標(biāo)準(zhǔn)來開展質(zhì)量控制，大多數(shù)原料生產(chǎn)商使用自身的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。鑒于保健食品與藥品的差異，制定保健食品用的硫酸軟骨素鈉原料標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)變得十分重要且緊迫。

2 質(zhì)量安全關(guān)鍵控制點

2.1 來源

不同來源的硫酸軟骨素鈉均由一個碳水化合物主鏈，不同百分比和位置的硫酸基雙糖組成，生成具有不同電荷密度的聚合物（圖1）。此外，不同聚合等級的硫酸軟骨素鈉可能產(chǎn)生不同的分子質(zhì)量和多分散性，這與特定的組織、器官和物種有關(guān)。正是由于這些結(jié)構(gòu)差異，不同來源的硫酸軟骨素鈉可能具有不同的生物學(xué)特性和能力。但是，將硫酸軟骨素鈉生物學(xué)特性與結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行對應(yīng)的相關(guān)文獻(xiàn)報道仍然很少。

圖1 不同類型硫酸軟骨素鈉化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of different types of sodium chondroitin sulfate

目前，硫酸軟骨素鈉主要來源于陸地動物，如豬、牛和雞，或海洋動物，如軟骨魚類、鯊魚和鰩魚。陸地動物軟骨中主要含有硫酸軟骨素鈉A，而海洋動物的軟骨中主要含有硫酸軟骨素鈉C，通過確定二糖分析和相對分子質(zhì)量可進(jìn)行確定。豬、牛和雞來源的硫酸軟骨素鈉二糖4S/6S 比值大于1，電荷密度小于1；而鯊魚等海洋動物來源的硫酸軟骨素鈉4S/6S 比值小于1，電荷密度大于1。但是在實際的商業(yè)生產(chǎn)中，混合來源也是十分常見的，可能生產(chǎn)出具有混合特性和性質(zhì)、結(jié)構(gòu)不受控制、重現(xiàn)性差以及具體來源無法確定的最終產(chǎn)品。已有報道顯示，在治療期間口服硫酸軟骨素鈉時，生物利用度和藥代動力學(xué)的變化取決于硫酸軟骨素鈉的結(jié)構(gòu)特征和來源，缺乏這些關(guān)鍵信息可能會影響實驗數(shù)據(jù)的解讀分析，不利于硫酸軟骨素鈉一些新的治療應(yīng)用的研究發(fā)展。因此，建立快速、準(zhǔn)確的硫酸軟骨素鈉物種來源鑒別方法，對硫酸軟骨素鈉來源的嚴(yán)格把控是非常有必要的。針對混合來源的硫酸軟骨素鈉，則需要有更加嚴(yán)格的限定。

2.2 潛在的外源污染物

動物來源生產(chǎn)的硫酸軟骨素鈉通常需要長而復(fù)雜的提取和純化過程，其主要目的是消除或減少其他分子的含量，如果控制不好就會造成硫酸軟骨素鈉的污染。依據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)文獻(xiàn)報道，高純度、高質(zhì)量的硫酸軟骨素鈉用于OA 治療，才具有較好的有效性和安全性。盡管隨著凈化工藝的發(fā)展，已經(jīng)可以實現(xiàn)生產(chǎn)更高質(zhì)量的硫酸軟骨素鈉，但是一些潛在的外源污染物的檢測仍然是不能忽視的環(huán)節(jié)。已知潛在的外源污染物主要包括其他多糖（以糖胺聚糖類為主）、蛋白質(zhì)、有機(jī)小分子、病毒、朊病毒和溶劑等。各國藥典和標(biāo)準(zhǔn)文件對其中一些雜質(zhì)設(shè)定了相應(yīng)的限量要求，但影響純度的其他多糖、常規(guī)手段難以去除的朊病毒需格外關(guān)注。

2.2.1 多糖 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）和硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）都屬于糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）類的天然大分子，由于它們普遍存在于生產(chǎn)硫酸軟骨素鈉的組織中，在硫酸軟骨素鈉產(chǎn)品中可被檢測到。此外，硫酸角質(zhì)素（keratan sulfate，KS）以蛋白多糖的形式存在于所有軟骨中，與硫酸軟骨素鈉有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，并且具備免疫原性，能夠產(chǎn)生免疫反應(yīng)，已在各種來源的硫酸軟骨素鈉成品中檢測到。例如：有研究顯示，在一些批次的商業(yè)化硫酸軟骨素鈉樣品中檢測到HA 含量高達(dá)1.5%，KS 的檢出率也在15%～20%左右。采用免疫擴(kuò)散和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測了15 份樣品，包括4 份作為實驗室試劑的硫酸軟骨素鈉，1 份作為食品添加劑的硫酸軟骨素鈉和10 份含有硫酸軟骨素鈉的膳食補(bǔ)充劑，結(jié)果顯示除了3 個作為實驗室試劑的硫酸軟骨素鈉樣品外，所有樣品均含有不同量的硫酸角質(zhì)素。這些多糖大分子可能導(dǎo)致副作用和過敏反應(yīng)均有所報道。另一方面，由于這些多糖的性質(zhì)和化學(xué)結(jié)構(gòu)與硫酸軟骨素鈉非常相似，常規(guī)的非特異性分析方法，如十六烷基氯化吡啶（CPC）滴定法和咔唑法可能無法檢測到硫酸軟骨素鈉中其他多糖的存在。因此，針對與硫酸軟骨素鈉性質(zhì)和結(jié)構(gòu)相似的多糖，需開發(fā)專屬性和準(zhǔn)確性更好的檢測方法。

2.2.2 朊病毒 用于硫酸軟骨素鈉生產(chǎn)的動物器官和組織中可能攜帶病原體，如細(xì)菌、病毒和朊病毒，可能會給硫酸軟骨素鈉產(chǎn)品帶來安全問題。雖然這類病原污染物可通過特定的化學(xué)反應(yīng)來破壞、滅活和消除，但是有可能導(dǎo)致硫酸軟骨素鈉發(fā)生降解、脫硫、碳水化合物鏈的氧化、化學(xué)基團(tuán)摻入等結(jié)構(gòu)上的改變。朊病毒是一類能侵染動物無免疫原性的疏水蛋白質(zhì)，附著在細(xì)胞表面，蛋白酶處理、常規(guī)化學(xué)試劑和高溫等處理方式都難以將其去除，朊病毒及其他具有相似屬性的病原體已成為動物源醫(yī)藥制品的一個主要問題。目前可用的朊病毒檢測分析方法成本高，而且僅限于專門的實驗室。因此，需要從動物源頭控制，或開發(fā)特異性、低成本的分析方法，來檢測硫酸軟骨素鈉終產(chǎn)品中可能存在的不同感染因子。

2.3 摻假

除了存在自然污染外，市場上流通的硫酸軟骨素鈉還可能被人為的添加更便宜的多糖和有機(jī)衍生物，部分多糖和有機(jī)衍生物無法用常規(guī)的檢測分析方法來測定。許多摻假的分子已被鑒定，如卡拉膠、蛋白質(zhì)和表面活性劑、便宜的多糖、海藻酸鈉、藻酸雙酯鈉、六偏磷酸鈉等。摻假的分子可能會干擾硫酸軟骨素鈉的常規(guī)定量分析方法，如CPC 滴定法和咔唑測定法，不能進(jìn)行有效區(qū)分，從而導(dǎo)致測定的硫酸軟骨素鈉含量被夸大。USP43 和EP10.0 均采用CPC 滴定法測定硫酸軟骨素鈉含量，采用電泳法進(jìn)行純度測定，可能與USP43 和EP10.0 規(guī)定的硫酸軟骨素鈉來源廣泛有關(guān)。我國2020 版藥典中規(guī)定使用酶解-高效液相色譜法測定硫酸軟骨素鈉含量，按外標(biāo)法以軟骨素二糖、6-硫酸化軟骨素二糖和4-硫酸化軟骨素二糖的峰面積之和計算。近些年的研究已證實，酶解-高效液相色譜、高效凝膠過濾色譜（HPSEC）、電泳等方法用于硫酸軟骨素鈉的摻假鑒別準(zhǔn)確率高。李瑩瑩等應(yīng)用太赫茲時域光譜（Terahertz Time-domain Spectroscopy，THz-TDS）技術(shù)和紅外光譜技術(shù)分別測定摻入六偏磷酸鈉的鯊魚硫酸軟骨素鈉模擬摻假品，對比研究發(fā)現(xiàn)，THz-TDS 作為一種準(zhǔn)確、快速、無損的新型光譜技術(shù)，更適合于鑒別鯊魚硫酸軟骨素鈉的六偏磷酸鈉摻假。目前鯊魚來源的硫酸軟骨素鈉價格昂貴，市場上摻假的情況較多，需要有針對性地優(yōu)化相應(yīng)的檢測方法。

3 結(jié)語

原料、生產(chǎn)工藝、污染物以及許多其他因素都會影響硫酸軟骨素鈉的結(jié)構(gòu)與活性，進(jìn)而影響硫酸軟骨素鈉的生物特性及營養(yǎng)和藥理功能，使得硫酸軟骨素鈉的質(zhì)量安全控制需要更多的關(guān)注和重視。本文通過對中國、美國、日本、歐洲藥典收載的硫酸軟骨素鈉原料標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)不同國家或地區(qū)執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)存在一定的差異。中國藥典由于使用單一來源，有其特殊性，但仍需完善其他來源硫酸軟骨素鈉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。綜合分析各國藥典標(biāo)準(zhǔn)與最新的研究成果，發(fā)現(xiàn)來源、潛在外源污染物、摻假等是影響硫酸軟骨素鈉質(zhì)量安全的關(guān)鍵點，需要進(jìn)一步開展針對性研究。未來還需要通過建立從動物原材料到成品的可追溯系統(tǒng)、完善的標(biāo)準(zhǔn)體系及檢驗檢測配套設(shè)施，不斷推動行業(yè)整體水平提升。