基底膜蛋白多糖對肌萎縮相關因子myostatin和IGF-1信號表達的影響

許 卓,楊壽君,石洪峰,王月英,平澤惠理

(1.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；2.日本東京順天堂大學老人疾患研究中心)

肌少癥(sarcopenia)又稱“肌肉減少癥”，由Rosenberg于1989年首次命名。國際肌少癥工作組將肌少癥定義為與增齡相關的進行性、全身肌量減少和(或)肌強度下降或肌肉生理功能減退[1]。大量研究表明，老年人群骨折與肌量減少、肌力下降、跌倒增加、骨量減低密切關聯。對患者生活質量及生存時間均造成嚴重影響，已成為威脅公眾健康的重要疾病之一。

細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)為肌肉衛星細胞再生、增殖、分化提供重要的細胞外環境[2]，基底膜蛋白聚糖(perlecan)作為細胞外基質主要的硫酸肝素類蛋白聚糖之一，廣泛存在于神經肌肉接合部，在肌肉細胞增殖過程中發揮重要調節作用[3-4]。肌肉生長抑制素(myostatin)和胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)分別作為肌肉增殖的抑制因子和促進因子在肌肉再生、增殖、分化過程中具有重要調控作用[5-6]。本研究旨在觀察perlecan對肌肉萎縮相關分子myostatin和IGF-1表達的影響，為明確perlecan在調節肌肉衛星細胞增殖中的作用及機制提供證據，并為治療肌少癥提供新的治療途徑。

1 材料與方法

1.1 肌肉衛星細胞培養及perlecan因子添加

采用Hashimoto等[7]介紹的單一肌纖維提取技術，從12周齡C57小鼠腓腸肌中培養原代肌衛星細胞，用含2%馬血清(Invitrogen)和0.05%雞胚提取物(MP Biomedicals)的DMEM (Invitrogen)處理90%融合度的成肌細胞11天備用(見圖1)。然后將肌衛星細胞分為實驗組和對照組，實驗組添加20ng /ml的perlecan因子，對照組添加同等劑量的正常培養液，同時進行30 min培養。

1.2 總蛋白提取

將perlecan刺激反應30 min后的兩組肌衛星細胞回收制備提取物，緩沖液包括50 mM Tris(pH 7.6)，0.5%脫氧膽酸鈉，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。勻漿在4℃，10,000 ×g離心15 min，收集收集上清液用于Western blot分析。

1.3 Weston blot分析

檢測總蛋白樣本中Myostatin(1∶100)和其下游通路的smad2/3以及phospho-smad2；IGF-1和其下游通路的Akt以及抗磷酸化Akt蛋白的水平。采用蛋白定量試劑盒(Pierce BCA蛋白測定試劑盒);然后用合適的勻漿緩沖液將樣品稀釋到相同的濃度。用SDS-PAGE分離含24 μg總蛋白的樣品，并轉移到聚偏二氟乙烯膜上。轉移后，用Ponceau S染色，在白光下用化學發光探測器(Amersham Imager 600)掃描后，用含0.1% Tween-20的tris緩沖鹽水對膜進行脫色，用5%脫脂牛奶在相同的緩沖液中室溫封閉1小時。然后沖洗膜，在4℃下與一抗孵育過夜，隨后與辣根過氧化物酶結合的抗小鼠抗體在室溫下孵育1小時。免疫檢測采用化學發光試劑和化學發光探測器(Amersham成像儀600)。用ImageJ軟件[8]測量捕獲圖像中的波段強度。使用了以下抗體：抗myostatin(1∶100)、抗TGF-β抗體(1∶500)，抗smad2/3抗體(1∶1000)、抗phospho-smad2抗體(Ser465/467)(1∶100)；抗IGF-1(1∶200)、抗Akt抗體(1∶1000)、抗磷酸化Akt抗體(1∶1000)。

1.4 定量RT-PCR檢測

根據試劑盒說明書使用TRIzol試劑(Invitrogen)分別從實驗組和對照組的肌肉衛星細胞中分離總RNA。1.5 μg總RNA，采用MMLV逆轉錄酶和oligo(dT)引物[9]生成cDNA，利用ABI PRISM 7500型快速序列檢測系統進行實時定量擴增，反應總體系為25 μl，并進行定量PCR樣本分析，以GAPDH作為內參。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 肌衛星細胞形態學觀察

按照單一肌纖維提純法進行肌肉衛星細胞培養，培養第5天時可見衛星細胞中呈梭形的細胞已貼壁生長，呈圓形細胞尚未貼壁(圖1A)。第7天時可見衛星細胞基本已經貼壁生長，并開始融合(圖1B)。第9天時培養細胞進一步增粗、變長，開始融合且呈方向性生長(圖1C)。第11天時細胞進一步融合形成許多長的肌管(圖1D)。

圖1 肌衛星細胞形態學觀察

2.2 在肌衛星細胞中，檢測myostatin和IGF-1及相關下游信號的蛋白免疫印記

2.2.1通過蛋白免疫檢測發現，perlecan添加組肌肉萎縮促進因子myostatin蛋白質表達量較對照組上升57%，肌肉萎縮抑制因子IGF-1蛋白質表達量較對照組下降31%，組間差異均具有統計學意義(P<0.05)，提示perlecan對肌肉萎縮相關因子myostatin及IGF-1表達具有顯著影響作用(見圖2)。

圖2 肌衛星細胞Myostatin和IGF-1蛋白免疫印跡定量檢測(*P<0.05)

2.2.2對照組和添加組分別用10 ng/ml的Myostatin處理30 min。通過抗磷酸化Smad2 (Ser465/467)抗體免疫印跡分析激活的Smad2。用抗Smad2/3抗體復制相同的印跡。Myostatin在對照組和添加組中都能激活Smad信號，而在添加組中，Myostatin下游信號通路的Smad2磷酸化出現過度表達37%，組間差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖3)。

圖3 肌衛星細胞中Smad信號通路磷酸化表達(*P<0.05)

2.2.3對照組和添加組用20 ng/ml的IGF-1處理30 min。通過抗磷酸化Akt抗體免疫印跡分析激活的Akt。用抗Smad2/3抗體復制相同的印跡。IGF-1在對照組和添加組中都能激活Akt信號通路，而在perlecan添加組中，發現IGF-1下游信號通路的Akt磷酸化表達水平降低63%，組間差異具有統計學意義(P<0.05)(見圖4)。

圖4 肌衛星細胞中Akt信號通路磷酸化表達(*P<0.05)

2.3 定量RT-PCR分析

通過定量RT-PCR檢測發現，perlecan添加組和對照組myostatin和IGF-1的mRNA表達變化情況(圖5)。結果顯示，perlecan添加組肌肉萎縮促進因子myostatin的mRNA表達量較對照組上升13%，肌肉萎縮抑制因子IGF-1表達量較對照組下降9%，組間差異均具有統計學意義(P<0.05)(見圖5)。

圖5 肌衛星細胞Myostatin及IGF-1定量PCR檢測結果比較(*P<0.05)

3 討論

目前隨著社會的不斷老齡化，由于肌少癥造成的肌肉力量減弱，身體動態平衡和靜態平衡能力下降等臨床表現較常見，病理表現為肌肉體積縮小，肌纖維變細或消失。通常肌肉組織依靠肌肉細胞促進因子和抑制因子的相互制約協調維持其動態平衡，而這種平衡受到細胞外基質等微環境內的多種自分泌或旁分泌因子調節，其中perlecan作為細胞外基質的重要組成分子，因其廣泛存在于神經肌肉結合部而在防治肌肉萎縮方面受到廣泛關注。

Perlecan是細胞外基質中硫酸肝素類蛋白聚糖之一，由核心蛋白和四條硫酸肝素(heparan sulfate，HS)側鏈組成，其核心蛋白含5個功能區，N 端附著有3條長的HS側鏈，核心蛋白功能區上還有一個HS側鏈的附著位點，可以通過四條硫酸肝素側鏈與相關細胞因子結合，從而影響細胞因子表達[10]。Perlecan作為一種穩定基質結構和細胞-基質相互作用的黏合劑，能介導生長因子信號對細胞增生和分化的作用[11]。本實驗在體外培養肌衛星細胞并添加Perlecan因子，經蛋白免疫印跡定量分析及PCR檢測發現，添加perlecan因子能促使肌肉衛星細胞中myostatin含量升高，同時使其下游Smad信號通路的磷酸化水平過表達。能夠使IGF-1含量降低，同時降低了其下游AKT信號通路的磷酸化表達水平。表明perlecan因子可能與肌肉萎縮促進因子myostatin呈正相關作用，與肌肉萎縮抑制因子IGF-1呈負相關作用，從而使perlecan在肌肉衛星細胞增殖過程中起到重要的調控作用。

另外，Ning L等研究表明[12]，perlecan缺乏導致p70S6k和Akt磷酸化水平降低，AMPKα磷酸化水平升高，并且通過激活mTORC1通路抑制自噬過程，而這種自噬反應可能成為增強骨骼肌萎縮治療療效的新靶點。Satoshi等研究發現[13]，在去神經支配過程中，perlecan通過激活FoxO信號和泛素-蛋白酶體系統，促進nNOS離域，刺激蛋白質降解和肌肉萎縮。這些研究都為perlecan因子在應用治療肌少癥方面提供了新的思路。

綜上所述，本研究結果表明perlecan因子對myostatin及IGF-1表達具有調控作用，其調節機制可能是其核心蛋白功能區上一個HS側鏈的附著位點上，通過四條硫酸肝素側鏈與myostatin和IGF-1兩個細胞因子相結合，從而影響細胞因子的表達。