基于Postn介導的TGF-β/NF-κB通路探討綠原酸改善心肌肥大的作用及機制研究

盧 娜，金立民，苑 野*

(吉林大學大學第一醫院 1.小兒心血管科;2.麻醉科,吉林 長春130021)

心肌肥大(CHT)是心力衰竭和心臟重塑等心臟病的病理表現之一，也是心律失常、心肌梗死和猝死原因之一[1-2]。探究心肌細胞肥大的機制并找到有效干預手段對于防止心肌肥大具有重要意義。然而，心肌肥大發病機制復雜，至今仍未完全闡明。骨膜蛋白(Postn)是心肌肥大的關鍵因子，現有研究發現Postn的水平與壓力超負荷引起的左心室肥厚密切相關，其在心臟重構及心肌纖維化過程中起到了介質的作用[3-4]。更進一步發現，Postn能夠誘導整合素α3，α5，β3，β5激活TGF-β/NF-κB核因子信號通路釋放ANP、腦鈉肽(BNP)和β-MHC等肥大標志物，進而促進心肌肥大[5]。綠原酸(CGA)是由咖啡酸與奎尼酸形成的縮酚酸，屬于苯丙素類化合物。CGA具有抗氧化清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒等生物活性[6-7]。研究發現，CGA在改善心肌肥大方面具有潛在的良好功效[8]。此外前期研究也發現CGA能夠顯著抑制Postn，然而，Postn介導的TGF-β通路是否參與CGA抑制心肌肥大少見報道[1-2]，鑒于此，本研究旨在借助心肌肥大細胞模型探究CGA通過Postn/TGF-β/NF-κB通路抑制心肌肥大的機制，為心肌肥大的有效治療和CGA的臨床應用提供新的思路和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細胞系 H9c2(ATCC)，胎牛血清、DMEM 培養基(HyClone 公司)，Postn、α3、α5、β3、β5、TGF-β、NF-κB、ANP、BNP和β-MHC單克隆抗體(Abcam)，綠原酸、AngⅡ(美國 Sigma 公司)，Lipofectamine 2000試劑盒(Thermo Fisher)，山羊抗兔二抗(上海碧云天)，CCK-8 細胞檢測試劑盒(上海碧云天)，Postn-siRNA(上海吉瑪生物有限公司)，引物(上海生工生物)，細胞凋亡檢測試劑盒(四正柏生物)，ELISA試劑盒(杭州聯科生物)。倒置顯微鏡(日本尼康公司)，流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)。凝膠成像分析系統(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1心肌細胞肥大模型構建 胰酶消化 H9c2 心肌細胞后接種于完全培養基，24 h 后換1%胎牛血清培養基同步化，采用1 μmol/L 濃度AngⅡ誘導48 h 后胰酶消化，用于后續實驗。

1.2.2分組及干預方法 將細胞分為：(1)對照組:DMEM 完全培養基作為安慰劑；(2)模型組：不做特殊處理；(3)Postn-siRNA組：采用Lipofectamine 2000試劑盒將Postn-siRNA轉染至模型細胞；(4)綠原酸組：培養基中加入綠原酸100 μmol /L；(5)Postn-siRNA+綠原酸組：綠原酸100 μmol /L+Postn-siRNA轉染。

1.3 觀察指標

1.3.1細胞表面積測定 各組細胞以1×104個/cm2密度種植于24孔板，置于Nikon倒置顯微鏡下采集圖像，隨機選取5個視野，每個視野選取10個細胞，應用 Image-Pro Plus 圖像分析軟件檢測細胞表面積，取均值。

1.3.2CCK-8 檢測細胞活力 于每孔中加入 10%CCK-8 溶液繼續培養 1.5 h，用酶標儀檢測 450 nm波長下吸光度(OD450)。細胞存活率%=(處理組OD450/對照組OD450)×100%。

1.3.3Western blot檢測蛋白表達 RIPA 裂解液裂解蛋白，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE分離目的蛋白，隨后轉膜，用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000 稀釋后一抗(Postn、α3、α5、β3、β5、TGF-β、NF-κB、ANP、BNP和β-MHC)，4℃ 搖床孵育過夜，TBST 洗膜后加入HRP標記二抗(1∶2 000)，室溫搖床1 h，以GAPDH 為內參，采用凝膠成像分析系統進行定量。

1.3.4RT-PCR檢測mRNA表達 采用Triozol提取細胞總RNA，用分光光度計測定所抽提RNA的濃度和純度，按照說明書進行cDNA 合成。取反轉錄產物進行Real-time PCR反應。按以下體系進行Real-time PCR反應:2×qPCR Mix 10 μl，primer 各2 μl，cDNA 2 μl，50×Rox 0.4 μl，加ddH2O至20 μl。反應程序:95℃ 10 s;60℃ 20 s;72℃15 s，共40個循環。以GAPDH為內參基因，采用相對定量 2-ΔΔCt計算 Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1 mRNA 相對表達量。

1.3.5流式細胞術檢測細胞凋亡 用4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，250 μl結合緩沖液重懸細胞，隨后加入5 μl Annexin V/FITC，室溫避光孵育5 min；再加入10 μl 20 μg/mL的PI溶液，最后加入400 μl PBS，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.4 統計分析

應用SPSS 26.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用LSD-t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞表面積比較

與對照組比較，模型組細胞表面積明顯增大(P<0.05)；與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細胞表面積明顯減小(P<0.05) ，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組表面積明顯減小(P<0.05) ，與對照組差異無統計學意義(P>0.05) 。詳見圖1。

圖1 各組細胞表面積比較

2.2 各組細胞活力比較

與對照組比較，模型組細胞活性明顯減少(P<0.05);與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細胞活性明顯增加(P<0.05)，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組活性明顯增加(P<0.05)，與對照組差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖2。

圖2 各組細胞活力比較

2.3 各組蛋白表達水平比較

與對照組比較，模型組Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1、ANP、BNP和β-MHC蛋白表達明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細胞上述蛋白表達明顯下調(P<0.05)，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組細胞上述蛋白表達明顯下調(P<0.05)，與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖3。

圖3 各組蛋白表達比較

2.4 各組細胞mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，模型組Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1 mRNA相對表達明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細胞上述mRNA表達明顯下調(P<0.05)，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)；與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組細胞上述mRNA表達明顯下調(P<0.05)，與對照組差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖4。

圖4 各組細胞mRNA相對表達水平比較

2.5 各組細胞凋亡率比較

與對照組比較，模型組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，Postn-siRNA組和綠原酸組細胞凋亡率明顯減小(P<0.05)，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05);與Postn-siRNA組和綠原酸組相比，Postn-siRNA+綠原酸組細胞凋亡率明顯減小(P<0.05)；與對照組差異無統計學意義(P>0.05) 。詳見圖5。

圖5 各組細胞凋亡率比較

3 討論

心肌肥大是心臟對多種心血管刺激出現的一種失代償性反應，未加干預可進展為心力衰竭等多種疾病，甚至猝死，心肌肥大是心血管疾病發病率和死亡率增高的主要原因之一[9]。因此防治心肌肥大對改善預后具有重要臨床意義。

Postn是一種由四個Fasciclin結構域組成的分子量為90 kDa的異功能分泌型細胞外基質蛋白，研究表明，Postn在調節長期壓力超負荷刺激和心肌梗死后的心肌肥大、間質纖維化和心室重構方面起著至關重要的作用[10-11]。研究顯示，在心肌細胞中，細胞外基質中的Postn可能會誘導TGF-β1的合成，激活TGF-β/NF-κB信號通路促進心肌肥大。由此可見，Postn/TGF-β/NF-κB信號通路在心肌細胞肥大中發揮重要作用，調節Postn的活性對于防治心肌肥大具有較大潛力。CGA廣泛存在于植物中，以金銀花、杜仲中的含量較高，具有廣泛的藥理作用，如具有降低血壓、恢復血管彈性和保護心臟等多種作用[12]。綜合現有研究表明，CGA在心肌肥大的治療中無論單獨治療還是聯合其他藥物使用均表現出極大的潛質，課題組前期研究發現CGA能夠顯著抑制Postn和TGF-β1的mRNA表達并抑制心肌肥大，且二者存在正相關性關系，但CGA對Postn和TGF-β1的抑制機制尚不清楚。AngⅡ是調節血壓和體液的重要激素，可通過升高血壓或直接刺激心肌成纖維細胞增殖，誘導心肌細胞肥大，因此，本研究采用AngⅡ構建心肌肥大細胞模型，通過加以CGA和(或)Postn干擾，觀察其對心肌細胞表面積，活力及凋亡的影響，同時觀察Postn/TGF-β/NF-κB信號通路相關蛋白變化，結果顯示，與對照組相比，模型組細胞表面積明顯下降，存活率明顯下降，凋亡率明顯增加，而分別給予CGA或Postn-siRNA后，上述指標變化均得到明顯逆轉，提示CGA或Postn-siRNA可以增加心肌肥大細胞活力，抑制凋亡，而同時給予CGA和Postn-siRNA干預，上述指標均與對照組無明顯差異，表明Postn通路參與CGA抑制的心肌肥大作用。為了進一步研究CGA對Postn/TGF-β/NF-κB通路的作用，本研究分別采用Western blot和RT-PCR檢測此通路相關蛋白及mRNA表達情況，結果顯示，給予CGA或Postn-siRNA后Postn、α3、α5、β3、β5、NF-κB、TGF-β1蛋白及mRNA表達、ANP、BNP和β-MHC蛋白表達均明顯下調(P<0.05)，表明CGA通過抑制Postn結合整合素α3、α5、β3、β5而抑制TGF-β/NF-κB核因子信號通路，從而減少釋放ANP、BNP和β-MHC，發揮抑制心肌肥大作用[4]。

綜上所述，綠原酸介導Postn/TGF-β/NF-κB通路調控細胞活性和凋亡，進而抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，在抑制心肌肥大進展過程中發揮重要作用。也為將Postn介導的TGF-β/NF-κB通路作為防治心肌肥大的分子靶點提供了新的科學依據，也進一步了解綠原酸在心肌肥大中的防治機制。