丹參酮II A對人宮頸癌Siha細胞增殖、代謝與凋亡的影響

劉霽萱，李詠梅

(北華大學基礎醫學院，吉林 吉林132013)

宮頸癌是全球女性發病和死亡的常見原因，僅在2020年就報告了604，000例新診斷病例和約342，000例死亡[1]。目前，許多用于癌癥治療的放療方法和化學藥物副作用較為嚴重，但隨著人們對中草藥了解的不斷深入，發現中藥的一些有效成分具有許多優點，如多環節、多靶點、多通道、毒性小等特點為抗癌藥物的研發提供了新的思路與新靶點[2]。丹參在亞洲被用作傳統中藥已有數千年的歷史。丹參酮IIA(TanIIA)作為其最豐富的有效成分之一，對于許多心血管、神經、呼吸、泌尿、消化和運動系統疾病發揮治療作用，并且對抑制癌細胞增殖和轉移，誘導細胞周期停滯和自噬，誘導腫瘤細胞凋亡等也有顯著的作用[3]。以往有研究表明[4]，丹參酮IIA可抑制含有HPV18陽性的宮頸癌細胞增殖，但對于HPV16陽性的宮頸癌細胞的抑制作用仍在探索階段。本實驗目的為探索不同濃度丹參酮II A作用于人宮頸鱗癌Siha細胞后對增殖、侵襲及代謝的影響及其可能的誘導機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和藥物

人宮頸鱗狀癌細胞Siha購于北納創聯生物科技公司。丹參酮ⅡA購自中國藥品生物制品檢定所，為化學標準品。

1.2 主要試劑

CCK-8試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、DEPC水均購于上海碧云天有限公司；Transwell小室、Matrigel膠，美國Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，美國BD生物公司；DMEM細胞培養液，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，GEMINI公司；葡糖糖測定試劑盒、乳酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗人PKM2、STAT3、Cyclin D1、Bcl-xl、MMP-2、MMP-9和GAPDH單克隆抗體以及抗兔二抗均購自于ABclonal公司。

1.3 主要儀器設備

CO2培養箱(Form311)，Thermo Fisher公司；酶標儀(Infinite M1000 Pro),TECAN公司；倒置顯微鏡(IX83)，奧林巴斯公司；流式細胞儀(EXFLOW-206)，達科為公司；凝膠成像儀(GelDoc EZ),PCR儀(T100TM)，Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1細胞培養 人宮頸癌Siha細胞常規體外培養在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中。每2天更換新鮮培養液，待細胞生長至密度80%-90%左右，進行傳代或凍存。

1.4.2CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期Siha細胞，待細胞生長密度至80%-90%左右，0.25%胰酶消化細胞，進行細胞計數，按照1.0×105/ml濃度接種于96孔板中，每孔加入200 μl細胞混懸液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養24 h。24 h后棄去培養液，設置對照組和不同濃度加藥組，加藥組分別加入含TanⅡA(0.5、1、2、4、8、16 mg/L)濃度的培養液100 μl，藥物刺激24 h，對照組不做藥物處理，只加入相同體積培養液，每組設置6個復孔，實驗重復3次。24 h后顯微鏡觀察細胞生長情況，每孔避光加入10 μl CCK-8溶液，放置于37℃，5%CO2飽和濕度培養箱培養1 h。1 h后，取出96孔板并使用酶標儀檢測波長在450 nm處各孔的OD值。

1.4.3劃痕實驗法檢測細胞遷移 取對數生長期的Siha細胞，待其長滿培養皿80%-90%，0.25%胰酶消化，按照3×105個細胞每孔數量接種于6孔板中，每孔3 ml，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養24 h，用200 μl槍頭對細胞進行劃痕處理，用PBS洗滌細胞三次，將劃下的貼壁細胞洗去，實驗組每孔加入不同濃度TanⅡ A(1 、2、4 mg/L)與培養基混合液，對照組不做藥物處理，只加入相同體積培養液，每孔3 ml，輕輕搖勻。每孔任意選擇3個不同視野，做好標記，倒置顯微鏡下觀察劃痕情況并拍照(0 h)，繼續培養24 h后同一視野再次拍照。實驗重復3次。

1.4.4Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力 稀釋Martrigel膠(Martrigel膠∶無血清培養基=1∶8)，將稀釋好的基質膠覆蓋在小室的上室，每孔100 μl，放置在細胞培養箱4小時，等待其凝固。取對數生長期的Siha細胞，按照每孔0.5×103個細胞，200 μl的體積接種于上層小室中，加入不同濃度的丹參酮II A(1、2、4 mg/L)進行藥物刺激，對照組不做藥物處理。下室加入500 μl含20%胎牛血清的培養基以誘導細胞侵襲，繼續培養24 h。取出上室，用棉簽擦拭小室中未侵襲的基質膠和細胞，棄下室培養液，使用4%多聚甲醛室溫固定15 min，棄固定液。然后加入500 μl結晶紫染色液室溫避光染色15 min，PBS洗滌細胞3次，洗除未與細胞結合的結晶紫。適當晾干后顯微鏡下拍照，使用Image J來統計細胞侵襲數量。

1.4.5流式細胞術檢測細胞凋亡 收集90%滿的對數生長期Siha細胞，細胞計數，調整細胞濃度3×105個/孔,均勻接種于6孔板中，放置培養箱中培養24 h后棄去培養液，加入不同濃度的丹參酮II A(1、2、4 mg/L)與培養基混合液進行藥物刺激，每孔3 ml，對照組不做藥物處理，加入相同體積培養液。計算時間，24 h后收集細胞，用無EDTA胰酶消化細胞后，加入15 ml離心管內，1 000 rpm，離心5 min，棄上清，PBS清洗兩次，加入PBS重懸細胞，再次離心，1 000 rpm，離心5 min，棄上清，用高壓后的去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，加入400 μl重懸細胞，然后加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，加入10 μl PI，冰上避光孵育5 min，上機檢測，調電壓，采集細胞凋亡圖譜。

1.4.6Western blot檢測 不同濃度TanⅡA處理細胞24 h后，離心收集細胞，加入預先配置好的RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解30 min，4℃下12 000 rpm，離心12 min，收集上清，提取細胞蛋白。BCA法測定蛋白濃度，根據目的蛋白的分子量大小選擇12%的分離膠和5%的濃縮膠進行配制，上樣，SDS-PAGE電泳，80V電泳30 min，待Marker跑至分離膠，調整為120V繼續電泳，觀察條帶達到凝膠1/3-2/3處時可停止電泳。濕轉法至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，260 mA，約1.5-2 h，將膜放入封閉液TBST(含5%BSA)中，室溫搖床封閉1-2 h。加入稀釋一抗(PKM2、STAT3、Bcl-xl、MMP-2均為1∶1000)，置于搖床4℃過夜。1×TBST洗滌3次，每次5-10 min。加入HPR標記的二抗，室溫孵育2 h，孵育結束后再次進行洗膜，5-10 min，共洗滌3次。ECL顯影，掃描記錄。以GAPDH表達量為對照觀察結果。

1.4.7葡萄糖攝取量及乳酸含量測定 取對數生長期Siha細胞，細胞計數，調整細胞濃度1×105個/ml進行鋪板，放入37℃，5%CO2培養箱培養。24 h后按照不同濃度(0、1、2、4 mg/L)分組加入藥物同時設置無細胞組以檢測單純培養基數值，放入37℃，5%CO2培養箱24 h后收集細胞，1 000 rpm，離心10 min，取上清，按照葡萄糖檢測試劑盒以及乳酸檢測試劑盒進行測定，乳酸含量測定同時將空白管、標準管、測定管的測量值分別設置為A、B、C。實驗重復3次，按照以下公式計算。

葡萄糖含量(mmol/L)=(△A測定-△A空白)/(△A標準-△A空白)×標準品濃度(mmol/L)×樣品稀釋倍數。

每組葡萄糖消耗值(mmol/L)=單純培養基所測數值-各實驗組培養基所測數值。

乳酸含量(mmol/L)=(C值-B值)/(A值-C值)×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數。

1.4.8數據統計分析 采用GraphPad Prism 9軟件對所得數據進行統計學分析和數據整合，組間差異用單因素One-Way ANOVA分析，數據均以均數±標準差表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8法檢測丹參酮Ⅱ A對Siha細胞增殖的影響

CCK-8結果可見，丹參酮II A作用于Siha細胞24 h后，Siha細胞的增殖抑制率隨丹參酮II A濃度的增加而逐漸升高，與未加藥組比較，差異顯著，見表1。

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對Siha細胞增殖的影響

2.2 劃痕實驗檢測丹參酮Ⅱ A對Siha細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗結果顯示，未加藥組向劃痕中央移動速度較快，而相較于1、2 、4 mg/L丹參酮ⅡA藥物刺激24小時后，隨著藥物濃度的升高，細胞愈合速度減慢，細胞遷移能力下降。見圖1。

圖1 不同濃度丹參酮ⅡA對宮頸癌Siha細胞遷移的影響

2.3 Transwell小室實驗檢測丹參酮Ⅱ A對Siha細胞侵襲能力的影響

Transwell小室實驗結果顯示，TanⅡA作用于Siha細胞24 h后，與對照組相比，1、2、4 mg/L濃度組的Siha細胞侵襲能力逐漸減弱，能夠穿過人工基底膜的Siha細胞數量逐漸減少，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖2、表2。

圖2 不同濃度丹參酮Ⅱ A對宮頸癌Siha細胞侵襲能力的影響

表2 各組細胞侵襲數量比較

2.4 Annexin-V/PI雙染法檢測丹參酮Ⅱ A作用于Siha細胞凋亡的情況

結果表明，與對照組相比，TanⅡA作用后明顯引起細胞凋亡，細胞凋亡率上升顯著，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 不同濃度丹參酮ⅡA對Siha細胞凋亡的影響

2.5 Tan ⅡA不同濃度對Siha細胞內PKM2、STAT3、Bcl-xl、MMP-2蛋白表達的影響

與對照組相比，經不同濃度加藥組作用于Siha細胞24 h后PKM2、STAT3、蛋白的表達水平明顯上調,Bcl-xl、MMP-2蛋白的表達水平顯著下調，并且隨著藥物濃度的升高，蛋白表達逐漸下降，呈劑量依賴性。如圖3。

圖3 各組Siha細胞內PKM2、STAT3、bcl-xl、MMP-2蛋白表達比較

2.6 丹參酮Ⅱ A作用于Siha細胞后對葡萄糖攝取量的影響

不同濃度丹參酮ⅡA作用于Siha細胞24 h后進行葡萄糖含量檢測，結果顯示，與對照組相比，隨著TanⅡA劑量增加，葡萄糖攝取量減少，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表4。

表4 不同濃度丹參酮ⅡA對Siha細胞葡萄糖攝取量的影響

2.7 檢測丹參酮Ⅱ A作用于Siha細胞后對乳酸生成含量的影響

檢測結果表明，丹參酮Ⅱ A對Siha細胞的抑制作用隨劑量增大乳酸生成含量逐漸減少，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，見表5。

表5 不同濃度丹參酮ⅡA對Siha細胞乳酸生成含量的影響

3 討論

宮頸癌是全球女性中最普遍的癌癥之一，在全世界范圍內受到廣泛重視，目前的治療策略主要包括外科手術、放療和化療，然而腫瘤細胞逐漸對各種化療藥物產生耐藥，并且伴隨一些副作用和毒性，使腫瘤患者生活質量大幅降低，因此仍需要尋找新的防治策略和方法來減輕患者痛苦、降低宮頸癌患者死亡率。本研究針對宮頸鱗癌Siha細胞，探討TanⅡ A對其增殖、代謝及凋亡有關的分子機制。

本實驗通過CCK-8、劃痕實驗、Transwell小室實驗以及流式細胞術檢測結果顯示，丹參酮Ⅱ A對于宮頸癌Siha細胞的增殖、遷移及侵襲有一定的抑制作用，并且可以誘導Siha細胞凋亡。

正常細胞只有在缺氧的情況下進行糖酵解，而腫瘤細胞即使在不缺氧的情況下也優先進行糖酵解，消耗更多的葡萄糖和產生更多的乳酸。本實驗研究結果提示，TanⅡ A作用后，Siha細胞葡萄糖攝取量與乳酸生成含量減少，這提示了TanⅡ A對其糖酵解產生影響。

報道顯示，2008年Lewis C.Cantley[5]通過移植瘤實驗發現PKM2具有促進腫瘤生長的優勢。在 2013年，Matthew Vander Heiden團隊[6]的研究采用了敲除PKM基因中PKM2特有的第十個外顯子的策略，發現PKM2的缺失反而會加速腫瘤的生長。2018年Nobuhiro Tanuma團隊[7]構建了新的基因敲除小鼠模型，分別以和內源PKM表達接近的水平在小鼠中只表達PKM1或者PKM2亞型。結果顯示，在致癌劑或癌基因誘導等多種腫瘤模型中，PKM1都促進了腫瘤的生長，而PKM2則抑制腫瘤生長。研究發現[8]，丙酮酸激酶M2激活劑促進四聚體形成并抑制腫瘤發生，PKM2與含磷酸酪氨酸的蛋白質相互作用，抑制酶活性并增加糖酵解代謝物的可用性以促進細胞增殖，這表明高丙酮酸激酶活性可能抑制腫瘤生長。PKM2的小分子激活劑可能通過干擾合成代謝來抑制腫瘤細胞增殖。本實驗結果顯示，Tan ⅡA作用于宮頸癌Siha細胞后，PKM2與信號轉導因子STAT3的蛋白表達增加，提示了Tan ⅡA 對PKM2有促表達作用，若按照Nobuhiro Tanuma[7]團隊推測，PKM2可抑制腫瘤生長，并且PKM2的小分子激活劑可能通過干擾合成代謝來抑制腫瘤細胞增殖。那么Tan ⅡA發揮抗腫瘤作用的機制可能是其作為小分子藥物對PKM2有激活作用，從而干擾了合成代謝，抑制了宮頸癌Siha細胞的增殖。

另外，有文獻報道，抗凋亡蛋白Bcl-xl的過度表達可抑制細胞凋亡，從而使細胞增殖數量和凋亡數量不平衡，即使細胞增殖能力沒有改變，但由于凋亡細胞數量的減少，也會導致細胞數量相對增多[9]。基質金屬蛋白酶(MMPs)活性的誘導有助于細胞間連接的解體和ECM的降解，從而克服細胞運動的物理限制，參與腫瘤侵襲，因而是抗腫瘤藥物的靶標[10]。本研究結果表明，Tan ⅡA作用于Siha細胞后，Bcl-xl和MMP-2的蛋白表達量呈下降趨勢，表明TanⅡA抑制Siha細胞的遷移、侵襲能力，誘導細胞凋亡可能與抑制MMP-2和Bcl-xl蛋白表達有關。

綜上，丹參酮ⅡA能夠對宮頸鱗癌Siha細胞的增殖、遷移和侵襲能力發揮抑制作用，并且誘導Siha細胞凋亡。推測發揮作用的機制可能是丹參酮ⅡA作為小分子藥物激活了PKM2的活性，通過影響腫瘤細胞糖酵解干擾了合成代謝，影響其下游信號轉導因子STAT3和抗凋亡蛋白Bcl-xl從而發揮抗腫瘤作用，并且通過下調基質金屬蛋白酶MMP-2的表達抑制Siha細胞的遷移和侵襲能力。但是，丹參酮ⅡA是如何激活了PKM2，還對糖酵解過程中合成代謝的哪些關鍵步驟發揮作用，以及其發揮作用的通路和上游分子仍有待深入研究和探討。