細胞外組蛋白在放射性肺損傷中的診斷作用及機制

劉立杰，銀 英，白立立，張小陸，霍新龍，于曉麟，顧 濤，賈洪菊，張 雙，華海俠

(秦皇島市第一醫院，河北 秦皇島066000)

放射治療是肺癌患者的主要治療手段之一，可以提高腫瘤的局部控制率。但由于肺是射線敏感器官，其組織細胞容易受到輻射的損壞[1]從而可以引發放射性肺損傷(RILI)。RILI的發病機制可能與炎癥反應、肺泡及內皮細胞損傷等有關[2]。在體外研究中，細胞外組蛋白可損傷內皮細胞[3]、刺激細胞因子的釋放[4]，并可以誘導嗜中性粒細胞細胞外誘捕網的形成和髓過氧化物酶的釋放。因此，推測細胞外組蛋白可能作為促炎介質在RILI的發生發展中占據重要地位。本研究擬通過收集接受胸部放療的肺癌患者并利用細胞實驗，測定細胞外組蛋白及相關炎癥因子以分析其動態變化規律。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2018年1月-2020年12月在本院首次診斷并進行放射治療的75例Ⅰ-ⅢB期肺癌患者進行分析。男性41例，女性34例，年齡45-72歲，中位年齡58歲。按組織病理類型分類：49例NSCLC，26例SCLC。按患者臨床TNM分期分類：19例Ⅰ-Ⅱ期，22例ⅢA期，34例ⅢB期。入組患者中36例進行同步或序貫化療。本研究獲醫學倫理委員會批準。

納入標準：(1)經病理證實臨床分期為Ⅰ-Ⅲ期的原發性肺癌患者。(2)此前未接受過胸部手術、放療或化學藥物治療。(3)預計生存時間>6個月。(4)卡氏功能狀態(KPS)評分≥70分。

排除標準：(1)放療未完成或者放療中未按照規定安排(5F/W)進行治療的患者。(2)隨訪時間未滿6個月或者死亡者。(3)KPS評分<70分。

1.2 放射治療

所有入組患者放療前已完成病史采集和體格檢查，行血常規、肝腎功能等檢驗已確定無放療禁忌。將患者經CT模擬定位后的圖像傳輸至瓦里安治療系統，醫師在CT定位圖像上使用肺窗及縱隔窗逐層勾畫靶區，放療方式采用調強放射治療，放療劑量54Gy-66Gy，中位劑量60Gy。處方劑量2Gy/次，1次/日，5次/周。

1.3 方法

于放療前1天、放療后第1天，第1、3、5周時抽取患者空腹外周靜脈全血3-5 ml，4℃靜止低溫冷藏于EDTA 抗凝管中。樣本處理：標本采集1 h內，3 000 r/min離心10 min。后將上清液提取至Eppendorf管內，-80℃冰箱保存。

采用ELISA方法測定血清細胞外組蛋白水平，采用化學比色法檢測血清髓過氧化物酶(MPO)活性，采用ELISA方法測定血清LDH含量，采用Luminex方法測定血清中多項細胞因子。細胞外組蛋白ELISA測定試劑盒及MPO、LDH試劑盒購自德國Roche公司；Luminex檢測系列細胞因子試劑盒購自美國Affymetrix eBioscience。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 體外實驗

常規培養人肺上皮細胞系(BEAS-2B)和人單核細胞系(U937)，待細胞生長至80%-90%融合度之后，將RILI組患者放療后1周血清按50%的比例添加，溫育培養24小時后取細胞上清液檢測LDH和炎癥因子。同時，一組細胞給予特異性抗組蛋白H4抗體(20 μg/ml)進行干預。

1.5 RILI評價標準

按照美國放射治療腫瘤協作組(RTOG)分級標準[5]進行分級評價，根據臨床癥狀、胸部X線片、胸部CT和肺功能喪失進行評分，分成0-Ⅴ級。評分包括三個主觀量表和兩個客觀量表。主觀評分包括咳嗽、呼吸困難和胸痛。客觀量表包括胸部X線片和胸部CT以及肺功能測試。Ⅰ級及以上即定義為RILI。

1.6 隨訪及統計學分析

采用SPSS21.0軟件對數據進行分析。計量資料正態分布以均數±標準差表示，兩組資料比較采用兩組獨立樣本t檢驗，非正態分布采用中位數及四分位數表示，應用秩和檢驗分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RILI發生率情況

75例肺癌患者中，發生RILI 17例，發生率為22.67%。17例RILI患者的發生時間為放射治療后1-6個月，中位時間為3.5個月。

2.2 肺癌患者放療后細胞外組蛋白水平的動態變化

與非RILI組相比，RILI組患者各時間點血清細胞外組蛋白水平(μg/ml) 總體差異有統計學意義(P<0.05)，隨時間變化，細胞外組蛋白水平逐漸升高，1w達高峰(52.34±1.03) μg/ml，3w、5w保持高水平。見圖1。

圖1 RILI組、非RILI組不同時間血清細胞外組蛋白水平變化

2.3 肺癌患者放療后LDH、MPO水平的動態變化

與非RILI組相比，RILI組患者各時間點LDH活性(U/L)總體差異有統計學意義(P<0.05)，隨時間變化，LDH活性在放療后1 d即開始升高(178.75±1.07)U/L，1w、3w、5w繼續保持在高水平。見圖2。

圖2 RILI組、非RILI組不同時間LDH活性變化規律

與非RILI組相比，RILI組患者各時間點 MPO活性(U/L)總體差異有統計學意義(P<0.05)，隨時間變化，MPO活性逐漸升高，3w達高峰(50.24±0.35)U/L，5w仍持續較高水平(圖3)。

圖3 RILI組、非RILI組不同時間MPO活性變化規律

2.4 肺癌患者放療后細胞因子水平的動態變化

與非RILI組相比，RILI組患者6種細胞因子(IL-1、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1和TNF-α)水平(pg/ml)均升高，并且在1-5w達高峰，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 RILI組、非RILI組不同時間6種細胞因子水平變化

2.5 細胞外組蛋白介導炎性損傷的細胞實驗

將放療前患者血清作為對照組，放療組LDH活性(U/L)明顯升高(238.03±1.02)U/L；與放療組相比，抗體干預組LDH活性則明顯降低(136.73±1.17)U/L，但仍高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 特異性抗組蛋白中和抗體拮抗放療后患者血清對人肺上皮細胞的損傷效應

與對照組相比，放療組6種細胞因子(IL-1、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1和TNF-α)水平(pg/ml)顯著升高；與放療組相比，抗體干預組細胞因子水平則顯著降低，但仍高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 特異性組蛋白中和抗體拮抗放療后患者血清對人U937細胞的細胞因子生成影響

3 討論

RILI是肺癌患者放射治療中常見的劑量限制性并發癥，早期主要表現為放射性肺炎，晚期則表現為不可逆肺纖維化[6]。盡管近年來放療技術在不斷進步，但RILI在肺癌放療患者中的發病率仍高達5%-25%，兼其防治措施有限，已經成為了放射劑量區域、腫瘤控制率等的限制性因素，是影響患者治療效果及預后的重要因素，嚴重時會導致患者死亡[7-9]。在RILI復雜多樣的發病機制中，炎癥占有重要地位。射線可通過細胞凋亡、壞死等引起細胞死亡，導致炎癥細胞浸潤[10]，從而激活細胞外損傷相關分子模式(DAMP)分子的釋放。DAMP分子在體內積聚并活化天然免疫細胞，引發不同的模式識別受體，如Toll樣受體和炎癥因子，繼而導致炎癥[11]。經射線照射后受損的上皮細胞和其他炎性細胞產生多種細胞因子和趨化因子[12]，這些因子在受輻射的肺組織中放大炎癥反應并觸發成纖維細胞活化與增殖，從而導致膠原沉積及慢性纖維化[13-14]。

組蛋白是高度保守的核內堿性陽離子蛋白，在細胞核內含量豐富且恒定，主要包括5種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4[15]。組蛋白在染色質重塑和基因轉錄中發揮關鍵作用[16]。研究發現,應激狀態時,免疫細胞表面和細胞質內可以檢測到組蛋白，其以一種細胞外誘捕網(NETs)的方式從活化的免疫細胞中釋放,該網是由中性粒細胞染色體成分和其他的抗菌蛋白所構成的纖維,發揮到捕獲與降解入侵微生物的作用[17]。但是，逐漸增多的中性粒細胞胞外誘捕網可以形成一種免疫細胞死亡的方式,該獨特的方式被稱為“NETosis”[18]。另外,細胞凋亡或壞死時染色質降解，核內組蛋白也可以被釋放至細胞外成為細胞外組蛋白[19]，通常和吞噬作用受損有關[20]。研究表明，細胞外組蛋白直接具有細胞毒性[21]或作為DAMP分子通過刺激免疫細胞(如中性粒細胞、單核/巨噬細胞和樹突細胞等)，進而激活下游信號通路產生多種細胞因子，觸發全身炎癥反應[3，22]。因此，本研究旨在探討細胞外組蛋白與放療相關炎癥反應的相關性。

在本研究中，觀察到放療后患者血清細胞外組蛋白水平明顯增加，同時出現免疫細胞活化和炎癥反應，炎性細胞因子及MPO水平升高均提示了放療后肺癌患者細胞外組蛋白與免疫細胞活化及大多數炎性細胞因子之間存在的明確的相關性。這與之前公布的數據一致[23]。此外，通過研究進一步闡述細胞外組蛋白的病理作用，結果提示放療后患者血清能直接誘導肺上皮細胞損傷和促進U937細胞釋放細胞因子，導致細胞外組蛋白相關炎性細胞因子顯著增加；而特異性抗組蛋白H4抗體則可以明顯抑制這一損傷效應，從而證實了細胞外組蛋白與放療相關的全身性炎癥之間的因果關系。基于研究觀察，可以得出RILI的可能發病機制：放療導致大量細胞死亡和免疫細胞活化，從而釋放細胞外組蛋白，進而促進相關炎癥細胞因子的釋放，介導炎性損傷。近年來，以細胞外組蛋白為靶點的保護措施亦是研究熱點。大量研究發現，特異性抗組蛋白H3、H4抗體[4，24],組蛋白阻斷劑如活化蛋白C[25]及肝素[26]可以有效拮抗細胞外組蛋白的毒性作用。可見，若能將細胞外組蛋白阻斷，中和或降解其細胞毒性作用，將有望從更深層面控制炎癥的發生發展，為臨床探索開辟一個新的方向。

總之，本研究結果揭示了細胞外組蛋白與全身性炎癥之間的關系。細胞外組蛋白可以作為反映放療相關系統性炎癥的生物標志物。