基于網絡藥理學方法分析葛根湯和黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的作用機制*

趙曉，黃飛麒，陳揚聲，魏源標，林展，張曉輝

（1.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣東廣州 510080；2.廣州體育學院，廣東廣州 510620）

頸椎病是指頸椎間盤組織發生退行性改變，以及其繼發病理改變累及到包括神經根、脊髓、椎動脈、交感神經、脊髓前中央動脈等的周圍組織結構，并出現與影像學改變相符合的臨床表現[4]。臨床上可分為頸型、神經根型、椎動脈型、交感型、脊髓型、混合型和食道型，其臨床表現有頸肩背痛、頭暈頭痛、上肢放射痛或麻木、肌肉萎縮、嚴重者雙下肢痙攣、行走困難，甚至四肢麻痹，大小便障礙，癱瘓等[5]，是骨科常見疾病之一。近年來隨著電子產品尤其是智能手機的普及，頸椎病的發病率呈上升趨勢。長時間低頭工作或保持單一固定姿勢或不良臥姿是該病重要的誘發因素[1]。流行病學調查發現高達73.2%的人患有頸肩痛，伏案工作人群頸肩痛的發生率為78.3%，且隨著每天伏案工作時間的延長，該病的發生率逐漸升高[2,3]。因此，頸椎病的預防及早期治療顯得尤為重要。目前，對于頸椎病的治療有手術治療和保守治療，其中，保守治療方法方式多樣，療效確切，臨床常用保守治療方法有中西醫藥物治療、針灸、推拿正骨、物理治療、小針刀治療、康復鍛煉等[6]。在這些療法中，頸椎病暫無特效藥物，西醫藥物治療多采取對癥治療為主，整體和遠期療效欠佳，且臨床廣泛應用的非甾體類消炎藥有著較高的胃腸道和心血管方面的副作用風險[7]；針灸、推拿正骨、物理治療、小針刀、康復鍛煉等方法雖然療效相對確切，但存在療程長[8]或者創傷性大[9]，導致患者依從性較低。

中藥內服治療頸椎病，經歷了早期的臨床個案報道、臨床療效總結、臨床實驗研究、動物實驗研究等階段，已取得較大進展,但所用藥物達數目繁多，可達150多種，重復性差[10]。研究組在臨床工作中曾單獨使用葛根湯合黃芪桂枝五物湯來治療頸椎病，發現效果顯著，這兩個方劑都是出自于《傷寒雜病論》，臨床研究[11-14]證實上述兩個方劑的療效確切，顯效率高于西醫藥物治療。在文獻回顧中，研究組發現對這兩個方劑的研究大多處于臨床研究階段，極少對其進行藥理研究及治療的作用靶點的研究。本研究利用網絡藥理學方法探討葛根湯及黃芪桂枝五物湯通過何種成分，利用機體的哪些靶點的作用，最終達到治療頸椎病的目的。

1 資料與方法

1.1 中藥活性成分的篩選和靶點 將葛根湯處方各藥味的中文名稱“葛根”，“麻黃”，“桂枝”，“生姜”，“甘草”，“大棗”，“白芍”以及黃芪桂枝五物湯中各中藥的中文名稱“黃芪”，“桂枝”，“大棗”，“生姜”，“白芍”分別作為兩組關鍵詞，輸入中藥系統藥理學數據庫和分析平臺[15](Traditional ChineseMedicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)，最后在CNKI上檢索相關文獻，并整理出未納入的中藥成分進行整理補充。獲取所有中藥成分以后，錄入TCMSP平臺以匹配信息，篩選活性成分條件為口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[16]。

1.2 構建葛根湯及黃芪桂枝五物湯的“活性成分-靶點”網絡 葛根湯與黃芪桂枝五物湯的“活性成分-靶點”網絡主要通過軟件Cytoscape 3.8.0來構建與分析，其中成分或靶點用“節點”(node)表示，二者之間的關系用“邊”(edge)表示。

1.3 cervical spondylosis相關靶點檢索以“cervical spondylosis”作為關鍵詞，在Genecards[17]數據庫、Disgenet[18]數據庫、OMIM數據庫的疾病基因數據庫進行檢索與篩選，將得到的靶點匯總并去除重復值，再根據文獻報道查找未預測到的有效成分的已知靶點，并利用Uniprot數據庫將所得靶點標準化。

1.4 建構靶蛋白相互作用（PPI）網絡 先取葛根湯與黃芪桂枝五物湯的交集靶點，再將湯劑的交集靶點與cervical spondylosis相關靶點取交集，最后將這部分靶點輸入string網站，基于STRING數據庫（http://string-db.org/）對篩選出的基因靶點構建相互作用關系網絡，把參數中的第一層最大交互者數設置為：不超過10個交互器，第二層設置為：不超過20個交互器，把最低互動得分設置為：中置信度（0.4000）。使用BisoGenet數據庫對篩選出的基因靶點構建相互作用關系網絡，可得到治療cervical spondylosis的PPI網絡圖，將所得圖導入Cytoscape 3.8.0軟件，繪制出PPI網絡圖。

1.5 關鍵靶點富集分析 將最終取得的核心靶點導入David[19,20]數據庫，進行基因本體（Gene Ontology，GO）分類富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encycloped of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。其中GO富集分為細胞組分(cell component，CC)、生物過程(biological Processes，BP)和 分 子 功 能(molecular function，MF)三種。由于富集靶標的數目和P有相關性，富集靶標越多，則表示與治療cervical spondylosis相關性越密切，其P值就會越小，本研究團隊選取GO富集數據中P＜0.01的結果數據，由大到小進行排序，將上述數據輸入微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制富集GO term BP，CC，MF三合一柱狀圖。選取COUNT數目排名前9的KEGG通路，使用微生信網站（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制氣泡圖，并將COUNT數目排名前5名的通路數據的基因名及通路名稱使用Cytoscape3.8.0軟件繪制通路關系圖。

2 結果

2.1 葛根湯和黃芪桂枝五物湯成分的篩選和靶點

2.1.1 葛根湯成分的篩選和靶點 以檢索TCMSP數據庫并根據OB和DL值初步篩選得到葛根湯活性成分371個：其中葛根16個，麻黃18個，桂枝9個，生姜8個，甘草204個，大棗82個，白芍34個；另外共有成分有15個：大棗，甘草，麻黃共有1個成分；大棗，甘草，白芍共有2個成分；大棗，生姜，白芍，葛根，桂枝共有1個成分；大棗，甘草，麻黃共有1個成分；大棗，桂枝，白芍共有1個成分；大棗，甘草共有1個成分；大棗，葛根共有1個成分；甘草，麻黃共有1個成分；白芍，桂枝甘草共有1個成分；甘草，葛根共有2個成分；甘草，白芍，麻黃共有1個成分；甘草，白芍共有1個成分；桂枝，葛根共有1個成分；桂枝，麻黃共有1個成分。將上述活性成分輸入uniport網站進行規范，最終得到葛根湯有效基因靶點：其中葛根312個，麻黃356個，桂枝194個，生姜81個，甘草2380個，大棗780個，白芍209個；去除重復值，得出有效基因靶點共194個。方中OB值排名2位的有效成分見下表：

表1 葛根湯方中OB值排名2位的有效成分

2.1.2 黃芪桂枝五物湯成分的篩選和靶點 以檢索TCMSP數據庫并根據OB和DL值初步篩選得到黃芪桂枝五物湯活性成分180個：其中黃芪47個，桂枝9個，大棗82個，生姜8個，白芍34個；另外共有成分有9個：黃芪，大棗共有3個成分；黃芪，白芍，大棗共有1個成分；白芍，黃芪共有1個成分；桂枝，生姜，大棗，白芍共有1個成分；桂枝白芍共有1個成分；桂枝，白芍，大棗共有1個成分；白芍，大棗共有1個成分。將上述活性成分輸入uniport網站進行規范，最終得到黃芪桂枝五物湯有效基因靶點：其中黃芪47個，桂枝194個，大棗780個，生姜81個，白芍209個；去除重復值，得出有效基因靶點共174個。方中OB值排名2位的有效成分見下表：

表2 黃芪桂枝五物湯方中OB值排名2位的有效成分

2.2 葛根湯及黃芪桂枝五物湯活性成分-有效靶點網絡構建

2.2.1 葛根湯活性成分-有效靶點網絡構建 將檢索出的葛根湯有效靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件中，構建葛根湯有效靶點網絡圖（圖1）。圖中下面黃色部分表示藥物的靶點，上面部分表示藥物成分：同心圓的外圈藍色四邊形表示甘草，同心圓的內圈紅色四邊形表示大棗，同心圓中間左上紫色四邊形表示葛根，同心圓中間右上淺粉紅色四邊形表示麻黃，同心圓中間左下黃色四邊形表示白芍，同心圓中間右下淺綠色四邊形表示生姜，同心圓中間右下翠綠色四邊形表示桂枝，同心圓中間呈一字排開的深粉紅色表示共同的藥物成分。由此可見，葛根湯中不同藥物可能對應同一成分，同一成分可能對應不同靶點；反之，同一靶點又可能對應不同藥物成分，不同藥物成分又可能對應同一藥物，最終得出葛根湯治療疾病可以通過不同成分作用于不同靶點而取得療效。

圖1 葛根湯有效靶點網絡圖

2.2.2 黃芪桂枝五物湯活性成分-有效靶點網絡構建 將檢索出的黃芪桂枝五物湯有效靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件中，構建黃芪桂枝五物湯有效靶點網絡圖（圖2）。圖中同心圓的最外圈紫紅色圓形節點表示藥物靶點，同心圓第二圈土黃色四邊形節點表示大棗成分，同心圓第三圈黃色四邊形節點表示黃芪成分，同心圓第四圈翠綠色四邊形節點表示白芍成分，同心圓第五圈藍色四邊形節點表示桂枝，同心圓第五圈玫紅色四邊形節點表示生姜，同心圓中心呈矩形排列的粉色八邊形節點表示共有成分。由此可見，黃芪桂枝五物湯中不同藥物可能對應同一成分，同一成分可能對應不同靶點；反之，同一靶點又可能對應不同藥物成分，不同藥物成分又可能對應同一藥物，最終得出黃芪桂枝五物湯治療疾病可以通過不同成分作用于不同靶點而取得療效。

圖2 黃芪桂枝五物湯有效靶點網絡圖

2.3 cervical spondylosis相關靶點檢索在Genecards數據庫、Disgenet數據庫、OMIM數據庫的疾病基因數據庫以“cervical spondylosis”作為關鍵詞進行檢索與篩選，同時根據近5年相關文獻查找未納入到的有效靶點。在Genecards數據庫中查找出54個靶點；在Disgenet數據庫中查找5個靶點；在OMIM數據庫中查找158個靶點，在近5年相關文獻未查找未納入的有效靶點。最終將所取得上述所有靶點匯總去除重復值，并利用Uniprot數據庫將所得靶點標準化，最終得到疾病靶點共211個。

2.4 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的靶點、PPI網絡構建

2.4.1 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療cervical spondylosis的交集靶點 將葛根湯有效基因靶點與黃芪桂枝五物湯有效基因靶點比對，經過篩選去除重復值，最終得到AR、ESR1、PGR、ACACA、ACHE、ACPP、ADRB2、AHR、ALOX5、BCL2等共170個交集靶點。將所取得的170個交集靶點與2.3中所取得的211個疾病靶點再次取交集，最終取得ESR1、IFNG、IL1B、IL6、MMP3、PTGS2、SOD1、TNF、TP53、COL3A1、DRD5、HMGCR共12個交集靶點。

2.4.2 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的PPI網絡構建將最終篩選出來的共同靶點導入STRING數據庫獲取靶蛋白的相互作用關系。雖然葛根湯及黃芪桂枝五物湯交集靶點與cervical spondylosis共有的靶點只有12個，但葛根湯及黃芪桂枝五物湯對cervical spondylosis的治療作用，并不僅限于靶點直接相互作用。因為每個靶點都處在蛋白相互作用關系網絡中，所以藥物和疾病靶點之間即便沒有直接相互作用，藥物和疾病靶點蛋白互作網絡之間也可能產生聯系。因此研究藥物對疾病的作用機制，不僅要研究直接作用靶點，還要研究蛋白互作網絡中間接作用機制。因此筆者把STRING網站上的參數中的第一層最大交互者數設置為：不超過10個交互器，第二層設置為：不超過20個交互器，把最低互動得分設置為：中置信度（0.4000）。將擴增所得到靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件中的bisogenet插件獲取靶蛋白的相互作用關系。使用Biso-Genet數據庫對篩選出的基因靶點構建相互作用關系網絡，可得到葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療cervical spondylosis的PPI網絡圖，將所得圖導入Cytoscape 3.8.0軟件，繪制出PPI網絡圖（圖3）。該PPI網絡圖共包含三個小圖，左側圖為通過原始交集靶點作出的網絡圖，包括3661個節點，125936條邊，經過計算得出BC、CC、DC的中位數分別為0.00000848、0.439、47，以此為條件截取出中間圖；中間圖包括1470個節點，62543條邊，經過計算得出BC、CC、DC的中位數分別為0.00291、0.465、96，以此為條件截取出右側圖；中間圖包括450個節點，16152條邊，圖中節點越大，圖中節點越大代表degree值越大，degree值排名在前5位的靶蛋白：TP53（抑癌基因53），NTRK1（1型神經營養性酪氨酸激酶受體），ESR1（雌激素受體1），CUL3，APP（淀粉樣前體蛋白）。

圖3 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的PPI網絡圖

2.5 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療cervical spondylosis的富集分析

將PPI網絡中的450個核心靶點基因導入DA-ⅤID數據庫，進行GO富集分析及KEGG通路富集分析。

2.5.1 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的GO富集分析GO富集分析結果顯示，450個相關靶點基因其中有430個核心靶點基因參與富集，共得到379個富集結果，其中包括分子功能（MF）98項，主要涉及蛋白結合、泛素蛋白連接酶結合、酶結合等；細胞組成（CC）178項，主要涉及細胞核、細胞胞漿、細胞核漿等；生物過程（BP）103項，主要涉及病毒過程、抑制表觀遺傳、促進及抑制RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄等。選擇P值＜0.01的富集結果，輸入微生信網絡，作圖如下（圖4）：

圖4 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的GO富集分析

2.5.2 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療cervical spondylosis的KEGG通路富集分析KEGG分析結果：450個相關靶點基因，其中有354個核心靶點基因參與115條信號通路過程，篩選COUNT數目排名前9位的通路，輸入微生信網絡（圖5），將基因數目排名前20位相關基因及通路導入Cytoscape 3.8.0繪制相關基因及通路關系圖（圖6）。

圖5 葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療cervical spondylosis排名前9位的KEGG通路

圖6 相關基因及通路關系圖

通過KEGG富集通路分析發現，腫瘤通路，HTLⅤ-I感染，乙肝，MAPK通路，細胞周期，病毒致癌過程，EB病毒致癌過程等通路與葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療cervical spondylosis的靶點關系密切。相關基因數最高的兩條通路如下：

圖7 癌癥相關基因及通路關系圖

圖8 致癌作用病毒相關基因及通路關系圖

3 討論

頸椎病是指頸椎間盤組織發生退行性改變，以及其繼發病理改變累及到包括神經根、脊髓、椎動脈、交感神經、脊髓前中央動脈等的周圍組織結構，因此目前臨床治療多從松解頸背部肌肉、調整頸椎的生理曲度及關節突關節等方面入手，短期效果明顯，但容易反復發作，長期效果欠佳。文獻回顧中發現研究切入點以炎癥因子[21]、細胞增殖與細胞周期[22,23]等方向為主，均能取得較好的療效。

葛根湯出自《傷寒論》，原方組成為：葛根四兩、麻黃三兩(去節)、桂枝二兩(去皮)、芍藥二兩(切)、甘草二兩(炙)、生姜三兩(切)、大棗十二枚(擘)，具有發汗解表，升津舒筋之功效。黃芪桂枝五物湯出自《金匱要略》，原方組成為：黃芪三兩、桂枝三兩、芍藥三兩、生姜六兩、大棗十二枚，具有補益氣血、通陽行痹、調和營衛的功效。兩方藥味精簡，配伍得當，問世近兩千年來療效顯著。兩方雖主治功效迥異，但在現代骨科臨床上常合方用于治療頸椎病，能收獲較好療效。

本研究基于網絡藥理學，探討葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的作用機制，共收集到葛根湯活性成分371個；黃芪桂枝五物湯活性成分180個；治療疾病的作用靶點共211個，提示葛根湯及黃芪桂枝五物湯可以利用不同有效成分通過多個靶點蛋白治療頸椎病。PPI網絡圖提示葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的作用機制較為復雜，核心靶點涉及的范圍可以分為細胞增殖及其周期、泛素化、炎癥因子及傷口愈合相關指標，GO和KEGG富集分析結果顯示，葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病涉及不同的生物過程及不同的信號通路，如腫瘤通路，MAPK通路，細胞周期，病毒致癌過程，EB病毒致癌過程等。本次網絡藥理研究結果PPI發現葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病degree值排名前30的核心蛋白主要參與調節軟骨及椎間盤細胞增殖凋亡以及調節細胞周期、促進神經修復等過程。如①TP53為細胞周期研究領域中的明星分子，目前體外細胞證實抑制TP53可促進人髓核細胞增殖作用[24]；同時亦有動物實驗證實干擾ESR1的表達可以通過抑制軟骨細胞凋亡進而促進細胞的增殖[25,26]；對于大鼠神經細胞的研究證實APP可抑制神經細胞凋亡,從而改善神經功能恢復[27]。②NTRK1與神經元修復有密切關系，動物實驗證實過表達NTRK1能夠促進神經元的再生[28]。分析P值排名前20位的KEGG通路可以發現葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的主要通路可以分為以下幾類：①調節神經及軟骨細胞的增殖、侵襲及凋亡：已經有臨床研究觀察到MAPK信號通路的激活會促進人頸椎椎間盤的退化[29]，動物實驗研究及文獻綜述表明調控MAPK信號通路的激活，可以影響神經及軟骨細胞的增殖速度，從而調節兩者的細胞周期[30,31]。基于上述結論，研究組推測對于治療頸椎病同樣可以通過抑制上述通路的功能，達到控制調控神經及軟骨細胞的有絲分裂，促進細胞增殖，延長細胞周期，從而治療頸椎病。②與腫瘤相關性：在本次網絡藥理研究中發現KEGG富集的結果有很多與惡性腫瘤的發生發展有關的信號通路。頸椎病在治療期間，需要讓局部組織有持續的血管新生，局部炎癥反應的減緩等過程。而這一系列的過程均與腫瘤的持續血管新生，促腫瘤炎癥反應等惡性腫瘤獲得性特征[32,33]相類似。研究組在回顧文獻中也發現目前有不少對滋養細胞的研究也以惡性腫瘤獲得性特征作為切入點[34-36]，因此研究組推測日后研究葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的作用可以借鑒腫瘤相關通路來完成。

綜上，葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的主要成分可能是槲皮素、芍藥苷、β-谷甾醇、芒柄花黃素、（+）-兒茶素、甘草酚等，主要通過TP53等蛋白通過腫瘤信號通路等信號通路影響多種生物行為。本次網絡藥理實驗同時發現了部分核心靶點分子及富集所得通路尚未被深入研究，同時根據文獻回顧結果，目前此類研究的對象集中在骨關節炎、腦缺血、帕金森病等模型，多以手法治療、針灸治療或針藥結合等作為干預手段，而研究藥物直接對頸椎椎間盤，軟骨形成，血管新生等的作用的試驗并不多見。由此，研究組推斷本次網絡藥理學研究為進一步明確葛根湯及黃芪桂枝五物湯治療頸椎病的機制開辟了新方向，但目前對于復方成分中不同藥物的藥量及相互作用分析仍缺乏系統研究模型，此后，我們可以進一步建立研究模型以實驗的方式來明確之間的區別。