魚油通過調節炎癥反應及氧化應激改善糖尿病大鼠認知障礙

周玉蘭 冀俊林 池興旺

(天津市東麗醫院神經內科，天津 300300)

2型糖尿病(T2DM)是一種與年齡相關的代謝性疾病。大量流行病學數據顯示〔1，2〕，T2DM患者認知功能障礙的風險較非糖尿病患者增加一倍，T2DM可能加速認知功能障礙。然而，T2DM認知功能障礙發病機制仍是未知的。影像學研究發現，糖尿病患者的大腦結構異常，可能加速認知能力的下降〔3，4〕。糖尿病大鼠模型實驗發現〔5〕，光學顯微鏡觀察海馬神經元數量明顯減少，海馬神經元形態異常。研究表明，神經炎癥和氧化應激可能是糖尿病認知功能障礙發生的關鍵因素〔6，7〕。一旦這些危險因素被激活，糖尿病患者的認知功能將很快下降，最終導致癡呆，這將極大地影響患者的生活質量，給患者和社會帶來巨大負擔。目前沒有有效的藥物可以預防或減緩糖尿病患者認知功能障礙的發生及進展。因此，開發有效的藥物預防或延緩糖尿病的認知障礙對人們來說是一個挑戰。

魚油是一種天然保健品，由海魚的脂肪精制而成，富含ω-單不飽和脂肪酸。海魚油含有4種長碳鏈多不飽和脂肪酸，包括花生四烯酸(AA)，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。魚油中的這4種長鏈脂肪酸EPA和DHA的含量較高，對人體健康有益。魚油具有增強免疫力〔8〕、預防類風濕關節炎〔9〕、預防脂肪肝〔10〕和抑制癌癥〔11〕的作用。另有研究表明〔12〕，魚油可能是預防和治療糖尿病和抑制癡呆的潛在藥物。為了解魚油如何預防糖尿病的認知障礙，本研究建立糖尿病動物模型來探索其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只成年雄性SD大鼠(160～180 g)由華北理工大學實驗動物中心提供。 動物處在受控溫度(22±2)℃和12∶12 h光/暗循環。 大鼠均按照實驗室動物指南的護理和使用進行實驗。大鼠高脂飲食(10%膽固醇10 ml/kg)2 w。 禁食過夜后，給大鼠腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(STZ)。 對照組注射生理鹽水。 在高脂肪飲食之前，將所有動物分成3組：對照組(n=10)和糖尿病組(n=10)，標準大鼠飼料喂養。糖尿病+魚油組(n=10)喂食含有4%魚油，持續喂養8 w。STZ給藥后72 h，血糖≥16.7 mmol/L的大鼠作為糖尿病模型。

1.2方法

1.2.1Morris水迷宮檢測 在魚油治療后8 w，使用Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)評估大鼠的學習和記憶能力。 在第52天，對所有動物進行定位航行試驗并持續4 d。 訓練大鼠尋找隱藏在水面下2 cm處的平臺，尋找和平臺所花費的時間被記錄為逃避潛伏期。 如果大鼠在60 s內未能找到平臺，則將其引置平臺上并使其保持10 s，逃避潛伏期記錄為60 s。 在第56天，移除隱藏的平臺，進行空間探索試驗以評估大鼠的空間記憶，給予大鼠60 s在池中自由游泳。 記錄目標象限中的大鼠所花費的時間，越過平臺的次數及游泳速度。

1.2.2組織病理學檢查 行為學檢測結束后，通過蘇木素-伊紅(HE)染色檢測海馬CA1區的形態學改變。戊巴比妥鈉(上海榕柏生物技術有限公司，貨號：37612；60 mg/kg)麻醉大鼠，200～300 ml 4%多聚甲醛(碧云天，P0099-100 ml)進行心臟灌注。 收集組織并后固定，包埋。 將石蠟組織塊切成5 μm厚的切片用于HE染色。 通過光學顯微鏡(奧林巴斯CX23)觀察海馬神經元形態。

1.2.3酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定組織勻漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-1β濃度 ELISA測定大鼠海馬組織中TNF-α(ab100785)，IL-1β(ab9722)和IL-6(234570)濃度〔22〕。 TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒購自Abcam公司。步驟均按照制造商的說明進行。 測定的海馬TNF-α，IL-1β和IL-6濃度的結果以pg/ml表示。

1.3海馬中過氧化物水平測定 將海馬的組織勻漿用于細胞因子測定。 使用脂質過氧化物(MDA)測定試劑盒(A003-1-2)和過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(A007-1-1；南京建成生物工程研究所，中國)分別評估MDA水平和CAT活性。 所有程序遵循制造商的說明。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0軟件和Sigma Plot10軟件進行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1魚油對實驗動物認知能力的改善 各組間游泳速度沒有明顯差異(P>0.05)。在定向巡航試驗中，糖尿病組比對照組花費更多時間尋找隱藏平臺；糖尿病明顯降低了糖尿病大鼠逃避潛伏期(P<0.05)。在空間探索測試中，糖尿病組穿越平臺象限的次數明顯少于對照組(P<0.05)；在魚油治療后，糖尿病大鼠穿越平臺象限的次數顯著增加(P<0.05)。見表1。

2.2魚油改善海馬神經元形態 在對照組中觀察到很少的異常神經元。在糖尿病組中，觀察到神經元混亂無序，染色模糊，數量減少。魚油治療緩解了上述異常的形態變化。見圖1。

2.3魚油抑制糖尿病誘導的神經炎癥 在糖尿病組海馬中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平顯著高于對照組(P<0.05)；糖尿病+魚油組海馬中炎癥因子水平較糖尿病組顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.4魚油對氧化應激標志物的影響 與對照組相比，糖尿病組海馬MDA水平顯著升高，CTA活性明顯降低(P<0.05)；糖尿病+魚油組海馬中的MDA活性較糖尿病組明顯降低，CAT活性明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組逃避潛伏期、穿臺次數、游泳速度及海馬IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MDA、CAT活性比較

3 討 論

T2DM是一種與年齡有關的全球范圍內流行的代謝性疾病。T2DM與認知障礙和癡呆有關，T2DM患者罹患阿爾茨海默病(AD)的風險明顯高于非糖尿病患者。 T2DM引起神經退行性疾病的機制仍不清楚，缺乏有效的藥物來預防或延緩疾病的進展。因此，尋找有效的治療方法或開發新的藥物來對抗糖尿病的認知障礙非常必要。

魚油改善了糖尿病大鼠的行為異常，并伴隨著海馬神經元的恢復，而神經元是負責學習和記憶的大腦區域。此外，本研究結果還表明，魚油的神經保護作用與減輕炎癥細胞因子和氧化應激有關。

大鼠持續性高血糖可能導致其行為異常，魚油可逆轉糖尿病引起的空間學習和記憶障礙。這與以前的研究相似〔13〕，報道補充了魚油可以通過抑制STZ-糖尿病大鼠的神經元凋亡來幫助影響記憶和學習能力。

據推測，促炎細胞因子的堆積會觸發神經炎癥，通過誘導活性氧(ROS)產生并降低抗氧化劑的水平而導致氧化應激〔14〕。本研究結果與先前的發現一致。據報道，強烈的免疫原性反應和氧化應激可能進一步引起神經元損傷〔15〕。 本研究結果表明，糖尿病大鼠中神經元的損傷與促炎性細胞因子和氧化應激密切相關。魚油減輕了糖尿病引起的腦損傷。魚油可以減少促炎因子的表達，從而抑制肝臟和其他組織的免疫原性反應。ω-3脂肪酸DHA是魚油中的活性成分之一，能夠通過抑制STZ糖尿病大鼠的海馬神經元凋亡來降低AD的風險并改善癥狀并增強學習功能。因此，本文初步確定魚油通過抑制促炎因子的表達從而抑制免疫原性反應和氧化應激而達到神經保護作用。但本研究的樣本量較小，且干預時間短，在后續研究中，應加大樣本量，延長干預時間，并將從RNA 水平探討促炎因子的表達，進一步完善魚油改善糖尿病認知功能障礙大鼠的機制。