結直腸癌淋巴結中M2型巨噬細胞和血清癌胚抗原水平相關性

王彥平 王季堃 劉金豪 陳彥雷 馬雪倩 馮揚 喬世峰

(錦州醫科大學附屬第一醫院 1結直腸外科2病區，遼寧 錦州 121001;2腫瘤病區)

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國發病率排第三位，死亡率居第四位，且逐年遞增〔1〕。然而僅有少數結直腸癌患者可在早期發現，大多數被確診時已經出現轉移，5年生存率大幅度降低。遠處轉移是導致結直腸癌患者死亡的主要原因，淋巴結轉移是結直腸癌最常見的轉移途徑，也是評估病情及判斷預后的重要因素。據統計，結直腸癌患5年生存率為70%，但由于存在淋巴結轉移，5年生存率降至13%〔2〕。目前關于結直腸癌淋巴結轉移具體機制尚未明確，因此成為研究熱點之一。研究表明，M2型巨噬細胞在腫瘤發生與發展中扮演著重要角色，并且CD163是M2型巨噬細胞的特異性標志〔3〕。癌胚抗原(CEA)是判斷結直腸癌嚴重程度的重要實驗室指標，也是結直腸癌發生轉移的特異性診斷指標〔4〕。本文檢測淋巴結組織中M2型巨噬細胞數量與血清CEA水平，探討其之間的關系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1～5月在錦州醫科大學附屬第一醫院結直腸外科2病區收治的結直腸癌患者104例，收集臨床資料及術后淋巴結組織標本。其中男70例，女34例，年齡38～89歲，平均(65.6±9.7)歲。分為淋巴結轉移組和淋巴結正常組。依據2017年美國癌癥聯合會(AJCC)臨床TNM分期標準：Ⅰ期15例，Ⅱ期41例，Ⅲ期43例，Ⅳ期5例。納入標準：①原發性結直腸癌；②初次接受手術治療；③同意參與本研究。排除標準：①確診之后接受過化療或放療等治療；②確診之后接受過免疫靶向治療；③有多個部位的腸道惡性腫瘤或合并其他系統惡性腫瘤。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2實驗方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶鏈接(SP)法：所有標本用甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的切片。經二甲苯脫蠟和乙醇水化后，乙二胺四乙酸緩沖液(pH9.0)加熱抗原修復，內源性過氧化物酶阻斷劑室溫下孵育10 min，山羊血清封閉30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入即用型鼠抗人CD163單克隆抗體室溫下孵育60 min，依次加入生物素標記的IgG聚合物及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，最后用二氨基聯苯胺(DAB)顯色和蘇木素進行染色，脫水封片。上述試劑均購自中國福州邁新生物技術有限公司。結果判定：巨噬細胞的細胞膜上出現黃色或棕黃色顆粒為CD163陽性表達。先低倍鏡下(×200)選取CD163陽性表達細胞數量最多的5個區域，然后在高倍鏡下(×400)計數并取平均值。光學生物顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產。術前采用電化學發光法測定血清CEA水平：所有研究對象清晨空腹采取靜脈血5～7 ml,離心留取血清，由該院檢驗科人員嚴格按照操作流程進行檢測。血清CEA≥5 ng/ml即陽性。免疫分析儀及檢測試劑盒均由美國羅氏公司生產。

1.3統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行獨立樣本t檢驗及χ2檢驗，M2型巨噬細胞數量與術前CEA水平之間的相關性采用Spearman 相關分析。

2 結 果

2.1兩組淋巴結組織中CD163表達 免疫組化結果顯示，淋巴結正常組M2型巨噬細胞主要浸潤到髓竇內；淋巴結轉移組M2型巨噬細胞主要浸潤到轉移腫瘤組織的間質內。見圖1。淋巴結轉移組M2型細胞數量〔(26.44±7.33)個〕顯著高于淋巴結正常組〔(14.66±4.38)個；P<0.05〕。

圖1 兩組CD163陽性表達(SP法，×400)

2.2淋巴結組織中M2型巨噬細胞數量與患者臨床病理參數的關系 M2型巨噬細胞在淋巴結組織中表達數量在腫瘤浸潤深度、TNM分期及有無淋巴結轉移上有明顯差異(t=4.598,10.224,10.224;P<0.05)。見表1。

表1 轉移淋巴結組織中M2型巨噬細胞數量與患者臨床病理參數的關系個)

2.3術前血清CEA水平與患者臨床病理參數的關系 術前CEA血清水平在腫瘤直徑、TNM分期、有無淋巴結轉移及分化程度上差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 術前血清CEA水平與患者臨床病理參數關系(n)

2.4術前血清CEA水平與淋巴結組織中M2型巨噬細胞數量相關性 Spearman相關性分析結果顯示，術前血清CEA水平與淋巴結組織中M2型巨噬細胞數量呈正相關(r=0.347,P=0.007)。見圖2。

圖2 術前血清CEA水平與M2型巨噬細胞數量相關性

3 討 論

巨噬細胞是腫瘤微環境中的主要免疫細胞，因具有表型和功能可塑性，可被微環境中不同細胞因子刺激分化為不同的表型，微環境中的干擾素-γ、脂多糖和腫瘤壞死因子-α等細胞因子刺激巨噬細胞分化為M1型巨噬細胞。而白細胞介素-4、白細胞介素-10和轉化生長因子(TGF)-β等細胞因子刺激巨噬細胞分化為M2巨噬細胞。M1巨噬細胞可分泌多種促炎細胞因子，主要起殺傷病原體和腫瘤細胞的作用，有助于免疫監測；M2巨噬細胞產生較低數量的促炎細胞因子和大量抗炎細胞因子，主要起到免疫抑制作用，有助于免疫耐受〔5〕。最近在胰腺癌的研究中表明，M2巨噬細胞浸潤前哨淋巴結的時間早于轉移腫瘤細胞〔6〕，所以本研究推測M2型巨噬細胞導致淋巴結內免疫抑制環境增強為腫瘤細胞轉移創造條件。既往研究表明〔7～9〕，M2型巨噬細胞在胃癌、結直腸癌及宮頸癌等惡性腫瘤組織中高表達與腫瘤細胞侵襲性增加顯著相關。本研究結果與既往研究結果一致。CEA是一種大分子量糖蛋白，參與腫瘤細胞黏附、轉移及抑制細胞免疫等多個方面〔10,11〕。在疾病的早期階段，CEA水平升高很少被檢測到，一旦檢測出來高于正常值表明患者預后較差〔12〕。研究證實CEA與TGF-βⅠ型受體(TGF-βRⅠ)結合，激活下游TGF-β/pSmad3信號通路促進腫瘤細胞增殖與轉移〔13〕。本研究結果提示CEA與結直腸癌進展有密切聯系。因此，術前血清CEA水平可評估結直腸癌患者的病情(如腫瘤分期和淋巴結轉移)，為臨床治療和判斷預后提供指導。經Spearmam相關性分析顯示，M2型巨噬細胞數量與術前CEA水平呈正相關，同時有學者發現CEA可刺激白細胞介素-10釋放，后者可激活酪氨酸激酶(JAK)1/信號傳導和轉錄活化因子(STAT)3信號通路而使巨噬細胞分化為M2型巨噬細胞〔14,15〕，恰好驗證了本研究分析結果。綜上，CEA與M2型巨噬細胞相互作用為腫瘤細胞創造免疫抑制環境，導致結直腸癌患者淋巴結轉移，可能為結直腸癌淋巴結轉移機制提供新的思路，M2型巨噬細胞可能成為治療結直腸癌新的靶點。