溫腎潛陽湯調(diào)控SIRT6表達(dá)治療高血壓腎損害的機(jī)制

王剛 艾望 周磊 劉濤 王珍 呂奇 金勁松

(1武漢市中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科，湖北 武漢 430051；2湖北省中醫(yī)院腎內(nèi)科)

高血壓為危害人類健康的主要心血管疾病之一，病情進(jìn)展緩慢，可誘導(dǎo)多器官功能損傷，腎臟是高血壓損傷的主要靶器官之一，高血壓可致慢性進(jìn)行性腎病，最終導(dǎo)致腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化，進(jìn)展為終末期腎衰竭〔1〕。研究表明，高血壓腎損傷早期病情具有一定隱匿性，隨著病情加重，腎功能損傷逐漸加重，最終導(dǎo)致腎衰竭，增加了臨床治療的難度且治療效果差，遠(yuǎn)期生存率低〔2〕。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎氣不足是高血壓病理的重要因素，腎陽不足、溫煦作用失常是其內(nèi)在病理表現(xiàn)，通過補(bǔ)腎填精、滋補(bǔ)肝腎、溫補(bǔ)腎陽、活血化瘀祛痰諸法調(diào)理腎臟功能，對于改善高血壓的治療現(xiàn)狀具有重要意義〔3〕。研究表明，高血壓腎損傷與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激有關(guān)〔4，5〕。SIRT6作為Sirtuin蛋白家族成員，也與腎損傷有關(guān)〔6〕。本文擬分析溫腎潛陽湯對高血壓腎損害的治療效果及治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買SPF級自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)24只和WKY雄性大鼠8只，16周齡雄性，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。在武漢市中醫(yī)醫(yī)院動物實驗室(SPF級)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，室溫(22±2)℃、相對濕度(55±5)%、光照周期12∶12 h。實驗期間保證所有大鼠飲水、飲食充足，定時更換敷料。藥物與主要試劑：溫腎潛陽湯由制附片6 g，肉桂6 g，炙甘草10 g，茯苓15 g，補(bǔ)骨脂30 g，生龍骨20 g，生牡蠣20 g，菟絲子15 g，芡實15 g，仙靈脾15 g組成，購自武漢市中醫(yī)醫(yī)院中藥房。生藥浸水1 h，大火煎沸30 min，小火煎30 min。過濾后的藥渣再次加水煮沸，重復(fù)2次，合并煎煮液，在水浴中濃縮，置4℃冰箱，按實驗需要濃縮備用；纈沙坦膠囊(代文)80 mg/粒，購自武漢市中醫(yī)醫(yī)院西藥房；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1試劑盒(ADL美國，批號：200911051558)；血尿素氮(BUN)試劑盒(建成生物工程研究所，南京)；血管緊張素(Ang)Ⅱ、尿微量白蛋白(m-ALB)試劑盒(安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，天津)；大鼠尾動脈血壓測定儀(Kent Scientific，美國)；PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad，美國)；BP-6型動物無創(chuàng)血壓測試儀(泰盟科技有限公司，成都)；Centrifuge5417R型離心機(jī)(賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，北京)；Leica2135型石蠟切片機(jī)；BM-11型病理組織包埋機(jī)(電子科學(xué)研究所，安徽)；JEM1200-EX透射電子顯微鏡(JEOL公司，日本)。

1.2動物分組及模型制備 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后收集SHR大鼠24 h尿液檢測m-ALB含量，以24 h尿液中m-ALB為20～200 mg/L為高血壓腎損害模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。將SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組、溫腎潛陽湯組，并以同齡WKY大鼠為對照組，每組8只。對照組和模型組每日灌胃給予2 ml生理鹽水；纈沙坦組給予纈沙坦按8 mg/kg灌胃；溫腎潛陽湯組給予16 g/kg溫腎潛陽湯煎劑灌胃。每組每日灌胃給藥一次，連續(xù)給藥8 w〔5〕。

1.3指標(biāo)檢測 末次給藥結(jié)束后，稱量各組體重。然后使用尾動脈血壓測量儀在大鼠尾動脈充分?jǐn)U張后檢測各組尾動脈血壓并進(jìn)行記錄〔7〕。

通過試劑盒檢測一般指標(biāo)，包括血肌酐(Scr)、BUN、24 h m-ALB、24 h尿蛋白(U-TP)。以代謝籠收集各組大鼠給藥結(jié)束后24 h尿液，混勻后收集約 10 ml中層尿液，離心，全自動生化儀檢測24 h U-TP含量，使用試劑盒測定24 h m-ALB水平。給藥結(jié)束后，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，血樣4 000 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書Scr和BUN水平〔8〕。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色檢測各組腎組織病理形態(tài) 切取大鼠腎臟組織，使用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(厚度為4 μm)，進(jìn)行HE 染色，光鏡下觀察腎臟病理形態(tài)學(xué)改變〔9〕。

1.5透射電鏡觀察各組腎臟超微結(jié)構(gòu) 取各組大鼠腎組織，生理鹽水清洗后擦干，切成1 cm3小塊，用2.5%戊二醛固定，然后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次。使用鋨酸染色后，樹脂包埋，切片(60 nm)，進(jìn)行復(fù)染，使用透射電子顯微鏡對腎臟標(biāo)本進(jìn)行觀察拍照〔10〕。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組Ang-Ⅱ、TGF-β1、一氧化氮(NO)水平 對小鼠腎組織進(jìn)行分離后取出上清液，參照小鼠ELISA試劑盒說明書檢測血清中Ang-Ⅱ、TGF-β1、NO水平，取適量蛋白樣品液，在組織標(biāo)本中加入50 μl樣本分析緩沖液，將其加入相應(yīng)孔中，并在室溫下孵育2 h，洗滌板5次，加入100 μl抗體工作液，在室溫下孵育1 h，加入酶結(jié)合物100 μl，避光孵育20 min，加入顯色劑后，避光孵育20 min，加入50 μl終止液，混勻后使用分光光度計測量450 nm處OD值，設(shè)置6個空白孔進(jìn)行平行對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各指標(biāo)濃度〔11〕。

1.7qRT-PCR檢測各組腎組織SIRT6、膠原蛋白(Collagen)Ⅰ、纖維連接蛋白(FN)表達(dá)水平 在無RNA酶條件下提取腎組織30 mg，使用RNA提取試劑盒分離出總的RNA，然后使用PrimeScriptTMRT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR在應(yīng)用生物系統(tǒng)QuantStudio6RT-PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，使用TBGreen?預(yù)處理ExTaqTMⅡ(TaKaRa)。qRT-PCR擴(kuò)增條件：在95℃下10 min，然后在95℃下40個周期10 s，在60℃下34 s。每個試驗重復(fù)進(jìn)行3次。采用2-ΔΔCt法測定靶基因的相對mRNA表達(dá)水平〔12〕。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1HE染色檢測各組腎組織病理形態(tài) 對照組腎組織未見明顯增厚、肥大和增生。與對照組相比，模型組腎組織增厚，平滑肌細(xì)胞肥大和增生，管壁內(nèi)膠原增加，管腔狹窄。與模型組相比，溫腎潛陽湯組、纈沙坦組腎臟細(xì)小動脈病變減輕，見圖1。

圖1 HE染色檢測各組腎組織病理形態(tài)(×100)

2.2透射電鏡觀察各組腎臟超微結(jié)構(gòu) 對照組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、大小正常，足突排列整齊規(guī)則；模型組內(nèi)皮細(xì)胞增大且形態(tài)不規(guī)則，足突融合、消失，系膜基質(zhì)增多；溫腎潛陽湯組和纈沙坦組內(nèi)皮細(xì)胞有輕微腫脹，形態(tài)欠規(guī)則，足突有小部分融合但排列較整齊，見圖2。

紅箭頭指示內(nèi)皮細(xì)胞；黃箭頭指示足突圖2 透射電鏡觀察各組腎臟超微結(jié)構(gòu)(×3 000)

2.3各組Scr、BUN、m-ALB、U-TP水平比較 模型組Scr、BUN、m-ALB、U-TP水平顯著高于對照組(P<0.05)；溫腎潛陽湯組、纈沙坦組顯著低于模型組(P<0.05)，見表1。

2.4各組體重和血壓水平 與對照組相比，模型組體重明顯降低，收縮壓及舒張壓明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，溫腎潛陽湯組、纈沙坦組體重明顯升高，收縮壓及舒張壓明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組Scr、BUN、m-ALB、U-TP水平比較

2.5各組Ang-Ⅱ、TGF-β1、NO水平比較 與對照組相比，模型組Ang-Ⅱ、TGF-β1水平明顯升高，NO水平明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，溫腎潛陽湯組、纈沙坦組Ang-Ⅱ、TGF-β1水平明顯降低，NO水平明顯升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組Ang-Ⅱ、TGF-β1、NO水平比較

2.6qRT-PCR檢測各組腎組織SIRT6、CollagenⅠ、FN表達(dá)水平 與對照組相比，模型組腎組織SIRT6水平明顯降低，CollagenⅠ、FN表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，溫腎潛陽湯組、纈沙坦組腎組織SIRT6水平明顯升高，CollagenⅠ、FN表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 qRT-PCR檢測各組腎組織SIRT6、CollagenⅠ、FN表達(dá)水平

3 討 論

高血壓腎病是指原發(fā)性高血壓引起的良性腎小動脈硬化和惡性小動脈腎硬化，并伴有相應(yīng)臨床表現(xiàn)的一種疾病，是高血壓常見的慢性并發(fā)癥之一，由高血壓導(dǎo)致的慢性腎病已成為終末期腎病的第2 位常見病因〔13〕。纈沙坦為AngⅡ受體拮抗劑類藥物，可有效拮抗血管緊張素受體，繼而發(fā)揮降壓作用，且臨床證實纈沙坦具有長效、安全性和特異性高等特點，在高血壓患者病情控制中效果較好〔14,15〕。BUN、SCr 是評估腎功能的關(guān)鍵指標(biāo)。m-ALB在腎臟出現(xiàn)損害時濃度上升〔16〕。說明溫腎潛陽湯可起到緩解腎損傷的作用。AngⅡ可通過與AT1R結(jié)合導(dǎo)致血管收縮、水鈉潴留，促進(jìn)醛固酮分泌，最終促使高血壓的發(fā)生〔17〕。此外，AngⅡ還可減少高血壓對腎臟、心臟等慢性損傷，而且與腎臟肥大、細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)合成增加而降解減少等有關(guān)，其中TGF-β1起關(guān)鍵作用〔18〕。AngⅡ異常表達(dá)可直接刺激TGF-β1活性，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分如各型膠原 Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、FN等啟動子的活性，從而增加 ECM 合成，導(dǎo)致腎纖維化，參與腎臟炎性反應(yīng)〔19,20〕。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓的發(fā)生發(fā)展伴隨全身慢性炎癥的發(fā)生，而炎癥因子浸潤腎臟后參與氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步加重腎臟炎癥〔21〕。NO是主要的舒血管物質(zhì)。本研究結(jié)果說明溫腎潛陽湯可起到降低血壓，抑制腎組織炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎組織的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6主要位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，對于調(diào)控腎臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用，SIRT6基因缺失會導(dǎo)致足細(xì)胞功能損傷，包括足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白及足突消失，同時可加速腎臟肥大和蛋白尿的進(jìn)展〔22〕。劉敏〔23〕研究也發(fā)現(xiàn)SIRT6可能是維持足細(xì)胞正常功能和形態(tài)的關(guān)鍵分子，主要可通過抗炎癥、抗凋亡、抑制足細(xì)胞骨架重排及調(diào)控足細(xì)胞自噬發(fā)揮足細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上，溫腎潛陽湯通過調(diào)控SIRT6的表達(dá)，能夠治療高血壓所導(dǎo)致的腎損害。