利拉魯肽對糖尿病腦梗死大鼠腦組織胰島素樣生長因子結合蛋白-3及血管生成的影響

卜一 張碩 錢旭東 王紅梅 竇志杰

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，河北 承德 067000)

糖尿病(DM)導致的代謝紊亂可引起大血管、毛細血管病變，是腦梗死的獨立危險因素之一；和非DM腦梗死比較，DM腦梗死患者腦組織血管狹窄病變程度更嚴重，病變支數更多；DM本身影響側支循環(huán)的建立，DM患者血糖水平升高是由單核細胞參與的大血管或毛細血管的形成能力及重塑能力降低〔1〕。利拉魯肽(LIRA)為胰高血糖素樣肽受體激動劑，在DM治療中被廣泛應用，可通過葡萄糖依賴性方式促進胰島素分泌〔2〕；在正常血糖腦梗死小鼠中有通過促進血管新生而促進腦梗死后神經功能恢復的作用〔3〕。胰島素樣生長因子(IGF)結合蛋白(IGFBP)-3在DM和心血管疾病中的作用越來越受到重視〔4〕，在新生血管形成中也發(fā)揮重要作用〔5〕。應芝英等〔6〕研究發(fā)現IGFBP-3在急性腦梗死患者血清中表達下降，分析IGFBP-3可能參與急性腦梗死的發(fā)病過程。本文以尼莫地平為陽性對照，對LIRA對DM腦梗死大鼠腦組織IGFBP-3及血管形成的影響進行研究，探討LIRA對DM腦梗死的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑 清潔級、健康、體重220～260 g、雌雄各半、SD大鼠購自北京市醫(yī)療器械檢驗所，許可證號：SYXK(京)2015-0005。2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、電化學發(fā)光(ECL)液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒、逆轉錄(RT)試劑盒(美國Bioworld公司)，蘇木素、水合氯醛、Trizol(上海碧云天生物技術公司)，兔抗鼠IGFBP-3多克隆抗體、兔抗鼠CD34多克隆抗體、兔抗鼠血管內皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2分組與建模 將144只大鼠根據隨機數字法分為對照組(C組)、生理鹽水組(S組)、利拉魯肽組(LIRA組)、尼莫地平組(N組)，每組36只。S組、N組和LIRA組建立DM腦梗死大鼠模型：將大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg，然后給予高脂肪食物喂養(yǎng)，共14 d，測量大鼠隨機血糖，連續(xù)7 d空腹血糖(FPG)>16.6 mmol/L為DM模型建立成功；水合氯醛麻醉DM模型大鼠，頸正中偏右側取豎直切口，暴露右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，采用經典的Longa經頸總動脈插入尼龍線栓致大腦中動脈閉塞法〔7〕建立急性腦梗死模型：在頸總動脈分叉處做一小切口，插入尼龍線栓至大腦中動脈起始段，插入深度為18～20 mm，2 h后麻醉大鼠，拔退線栓。C組正常飼料飲食；術中插線深度10 mm，其他步驟同生理鹽水組。

1.3神經行為學評分 術后24 h，采用Bederson等〔8〕評分方法對各組進行神經行為學評分。無神經缺損癥狀為0分，對側前肢不能伸展為1分，行走向對側轉圈為2分，行走向對側傾倒為3分，意識受抑制不能行走為4分，死亡為5分。S組、LIRA組和N組神經行為學評分1～3分為建模成功，評分0分、4分及5分者予以剔除，取大鼠按照上述方法建模予以補充。

1.4處理 神經行為學評分結束后，N組給予二甲雙胍〔27 mg/(kg·d)，2次/d〕及尼莫地平〔2.16 mg/(kg·d)，2次/d〕灌胃；LIRA組給予二甲雙胍〔27 mg/(kg·d)，2次/d〕及LIRA〔0.4 mg/(kg·d)，1次/d〕皮下注射〔9〕；C組和S組皮下注射等量生理鹽水。共14 d。治療后再次進行神經行為學評分，方法同上。

1.5取材 治療結束后，每組取12只大鼠過量麻醉處理，斷頭取腦用于TTC染色；每組取12只大鼠深度麻醉后，經心臟灌注生理鹽水，然后灌注多聚甲醛，至大鼠四肢微顫、全身僵硬，取出大腦組織，于多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片呈厚4 μm切片用于免疫組化染色；每組取12只剩余大鼠，深度麻醉后冰上斷頭取腦組織，液氮中保存，用于RT-PCR。

1.6TTC染色 將腦組織冰凍30 min，切成2 mm厚切片，在TTC中孵育15 min(每5 min翻動1次)，紅色染色為正常腦組織，白色染色為腦梗死組織，TTC染色后放入多聚甲醛中，過夜浸泡，腦梗死面積采用Image J軟件測定，計算腦梗死體積(腦梗死體積比=患側腦梗死體積/患側腦半球體積×100%)。

1.7免疫組化染色測定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF表達及CD34+微血管密度 將切片于烤箱中烤2 h，經脫蠟、脫水，加入枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復，加入過氧化氫孵育10 min，山羊血清封閉30 min，加入IGFBP-3、VEGF、CD34一抗(稀釋比例：1∶200、1∶200、1∶50)過夜孵育，加入生物素標記二抗孵育30 min，C組以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，加入二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素染色5 min，加入鹽酸酒精分化2 s，碳酸鋰返藍30 s，二甲苯透明，中性樹膠封片。圖像采用Image-Pro Plus軟件處理。

1.8Western印跡測定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF蛋白水平 取缺血皮層區(qū)腦組織，提取總蛋白質，經凝膠電泳、轉膜、封閉后，加入一抗：兔抗鼠IGFBP-3單克隆抗體和兔抗鼠VEGF單克隆抗體，一抗稀釋比例1∶300，過夜孵育，加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，以β-actin為內參，蛋白條帶灰度值用Image J圖像分析軟件分析。IGFBP-3、VEGF蛋白水平=IGFBP-3、VEGF蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值。

1.9RT-PCR測定腦組織缺血皮層區(qū)IGFBP-3、VEGF mRNA水平 取缺血皮層區(qū)腦組織，勻漿，提取腦組織總RNA，逆轉錄為cDNA，進行PCR擴增，以GAPDH為內參，反應條件為：預反應：95℃ 30 s；PCR：95℃ 10 s、60℃ 30 s，共42個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示IGFBP-3、VEGF mRNA水平。引物序列IGFBP-3上游引物：5′-AGAGCACAGATACCCAGAAC T-3′,下游：5′-GGTGATTCATGTTGTCTTCCAT T-3′;VEGF上游引物：5′-CGGATCAAACCTCACCAA-3′下游：5′-TCTCCGCTCTGAACGAGG-3′;GAPDH上游引物：5′-CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT-3′下游：5′-GAGA-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組隨機血糖和神經評分比較 C組無神經功能缺損，隨機血糖正常；與C組比較，S組隨機血糖和神經功能評分增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與S組比較，LIRA組和N組隨機血糖和神經功能評分下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，LIRA組和N組隨機血糖和神經功能評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組隨機血糖和神經功能評分比較

2.2各組腦組織TTC染色比較 C組腦組織無白色梗死灶出現，S組腦組織有白色梗死灶出現，腦梗死體積〔(34.25±4.12)%〕；與S組比較，LIRA組〔(12.35±2.57)%〕和N組〔(11.28±2.74)%〕大鼠腦梗死體積均明顯減少(t=15.623、16.082，P=0.000)，LIRA組和N組腦梗死體積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組腦組織TTC染色

2.3各組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF免疫組化染色 C組缺血皮層區(qū)有少量IGFBP-3和VEGF表達，S組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF表達增強，LIRA組和N組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF表達進一步增強。見圖2和圖3。各組IGFBP-3和VEGF IOD值比較：C組

圖2 各組腦組織IGFBP-3(免疫組化染色，×400)

圖3 各組缺血皮層區(qū)VEGF(免疫組化染色，×400)

表2 各組缺血皮層區(qū)IGFBP-3和VEGF IOD值、微血管密度及腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白和mRNA水平比較

2.4各組缺血皮層區(qū)微血管密度比較 各組缺血皮層區(qū)微血管密度比較：C組

圖4 免疫組化測定各組缺血皮層區(qū)中CD34+微血管密度(×200)

2.5各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比較 各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白及mRNA水平比較：C組

圖5 Western印跡測定各組腦組織IGFBP-3、VEGF蛋白水平

3 討 論

LIRA為胰高血糖素樣肽受體激動劑，有降糖作用，可通過抑制胰高血糖素分泌、促進胰島素分泌而發(fā)揮降糖作用，在DM治療中被廣泛應用〔10〕；LIRA還可通過血腦屏障，胰高血糖素樣肽受體在下丘腦、小腦、海馬組織及神經細胞中均有表達，LIRA可通過激活腦組織中胰高血糖素樣肽受體減輕炎癥反應、抑制細胞凋亡、促進神經元修復等，從而對腦組織發(fā)揮保護作用〔11〕。尼莫地平可有效抑制鈣離子內流、抑制血管平滑肌收縮、解除血管痙攣，從而改善腦供血，保護神經元，在腦梗死治療中療效顯著。本研究結果表明LIRA對DM腦梗死有保護作用。

LIRA不僅有降血糖和神經保護作用，在血管新生中也發(fā)揮重要作用，如Chen等〔12〕研究發(fā)現LIRA可促進小鼠局灶性腦缺血后的血管生成。腦梗死后引起微循環(huán)缺血，腦缺血還可引起血管內皮細胞凋亡和功能失調，造成血管壁病變〔13〕。DM患者的高血糖可引起血管新生能力下降，腦梗死后腦缺血局部血氧供應減少也顯著降低血管新生能力〔14〕。因此改善DM腦梗死的血管新生能力有重要意義〔15〕。CD34主要在毛細血管網中表達，在大血管內皮中不表達CD34，本研究結果表明LIRA可能通過促進腦組織新生血管生成發(fā)揮腦梗死保護作用。分析LIRA可能通過促進DM腦梗死大鼠腦組織血管生成能力減輕腦梗死體積、改善神經功能損傷程度。

IGF信號系統(tǒng)在血管生成方面發(fā)揮重要作用，IGFBPs為IGF信號系統(tǒng)的組成部分，與IGF的親和力比較強，在IGF系統(tǒng)的生物活性調控中有重要作用。IGFBP3和血管形成關系比較密切，在不同疾病中對血管形成的作用不同，在胰腺癌等惡性腫瘤中有抑制血管生成的作用〔16〕；但在類風濕關節(jié)炎中有促進血管生成的作用〔17〕。VEGF具有促進血管生成作用〔18，19〕。IGFBP-3和VEGF共同參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程〔20〕，下調VEGF可抑制IGFBP-3的表達〔21〕。尼莫地平有促進VEGF表達，改善高血壓腦出血患者神經功能的作用〔22〕。本研究結果表明LIRA可能通過促進IGFBP3表達促進DM腦梗死大鼠腦組織新生血管生成。

綜上，LIRA對DM腦梗死大鼠有腦保護作用，其療效與尼莫地平相當，但LIRA在促進腦組織IGFBP3表達和血管新生能力方面優(yōu)于尼莫地平，LIRA可能通過促進腦組織IGFBP3表達和血管新生能力發(fā)揮對DM腦梗死大鼠的腦保護作用。