基于生物信息學分析鑒定阿爾茨海默病中關鍵差異表達基因及其潛在治療靶點

范加琳 來賀歡 李荷 李歡歡 周海云 吳紹長

(1麗水市第二人民醫院，浙江 麗水 323000；2麗水市中心醫院)

阿爾茨海默病(AD)是以認知障礙和晚期癡呆為主要特征的神經退行性疾病，是當今最大的流行病和健康挑戰之一。目前AD的病理特征普遍認為是淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經原纖維(NFT，主要為高度磷酸化的tau蛋白)纏結和不同大腦區域的退行性改變〔1〕。AD具有復雜的多種致病因素，如遺傳因素、環境因素、免疫因素、抑郁癥或高血壓等〔2～4〕。這些因素中，遺傳因素約占AD風險的70%〔5〕。已知的引起AD的遺傳原因包括編碼淀粉樣前體蛋白(APP)，早老素(PSEN)1和PSEN2基因的顯著改變，這些基因增強了Aβ的產生和聚集。然而，APP、PSEN1和PSEN2僅是AD致病機制的一部分〔6，7〕。此外，遺傳學分析表明，AD的個體差異可能是由多個基因及其變異引起，這些基因發揮各種生物學功能，以協同調節疾病風險〔8〕。除了與AD發病機制有關的識別機制外，對潛在候選基因的全面分析可能會為AD的預測或診斷測試提供新策略。本文擬利用生物信息學分析挖掘AD相關基因芯片，尋找其差異表達基因構建蛋白質相互作用網絡，進而發現網絡中的關鍵基因，為AD的診斷及治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1基因表達芯片 GSE132903基因表達譜從基因表達綜合數據庫(GEO)下載。該表達譜來自GPL10558(Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip)。GSE132903數據集中包含195個樣本，包括正常對照組和AD患者的微陣列數據，樣本全部來自顳中回。

1.2差異基因分析 采用R語言和Bioconductor中的Limma數據包分析數據集中的差異基因。篩選標準為P<0.05且差異倍數>0.5。

1.3差異基因功能富集分析 利用DAVID在線工具對差異基因進行GO和KEGG分析。

1.4差異基因蛋白質互作網絡的構建 利用STRING數據庫構建蛋白質相互作用網絡。

1.5關鍵基因(Hub)的篩選 利用Cytoscape在線軟件中的插件CytoHubba進行篩選，其中包含11種關鍵基因篩選的算法。本研究選擇其中常用的6種算法，通過取交集得到最終的關鍵基因。

2 結 果

2.1差異表達基因 共得到319個差異表達基因，其中有201個下調基因，118個上調基因，見圖1。

紅色代表上調基因，綠色代表下調基因圖1 AD患者樣本與健康對照樣本差異表達基因的火山圖

2.2功能富集結果 AD患者與正常對照差異表達基因的GO富集分析結果表明，信號釋放、神經遞質功能、突觸功能等生物學過程與AD密切相關。突觸膜、運輸小泡、運輸囊泡膜、神經元等細胞組分與AD的發生密切相關。GO富集分析的分子功能主要富集于鈣調素結合、SNARE復合體結合、突觸融合蛋白結合、離子通道活性等，見圖2。進一步對差異表達基因進行KEGG富集分析發現神經組織的配體-受體相互作用、突觸囊泡循環、胰島素分泌等通路對AD的發生密切相關，見圖3。

圖2 AD患者樣本與正常對照樣本差異表達基因GO富集和注釋結果

圖3 AD患者樣本與正常對照樣本差異表達基因KEGG富集和注釋結果

2.3蛋白質相互作用網絡 利用差異基因構建的蛋白質相互作用網絡，其中有239個網絡節點，紅色代表上調基因，綠色代表下調基因，與其他蛋白質相互作用越多，節點越大，作用越強，連線越粗，見圖4。

圖4 AD患者樣本與正常對照樣本差異表達基因的蛋白質相互作用網絡

2.4關鍵基因篩選 基于cytoHubba中的6種算法，分別選取前10個關鍵基因然后取交集，最大集團中心性(MCC)：SNAP25、SYP、SYN2、CPLX2、SYT4、CPLX1、STXBP1、NSF、SYT1、STX1A；最大鄰域分量(MNC)：SNAP25、SYP、GABRG2、SYT4、SYT1、GABRA1、GAD2、VAMP2、SYN2、NRXN1；度數(Degree)：SNAP25、SYP、SYT1、GABRG2、SYT4、GABRA1、GAD2、NRXN1、SYN2、GFAP；邊緣滲透分量(EPC)：SNAP25、SYP、GABRG2、SYN2、SYT4、SYT1、GAD2、NRXN1、GABRA1、CPLX2；接近中心性(Closeness)：SNAP25、SYP、GABRG2、GABRA1、GAD2、GFAP、SYT1、SYT4、STMN2、NRXN1；輻射度(Radiality)：SNAP25、SYP、GABRG2、GFAP、GABRA1、GAD2、STMN2、SYT1、SYT4、GAD1。最終得到SNAP25、SYP、SYT1、SYT4。

3 討 論

AD是一種遺傳上復雜的神經退行性疾病，雖然目前已有許多治療方法，但其治療效果差，給家庭和社會帶來很大負擔。到目前為止AD的發病原因尚不清楚，但tau蛋白的高度磷酸化、Aβ沉積等諸多因素，在AD的病理生理學中扮演重要角色。由于AD病因的多樣性，也因此提出了許多關于AD發病機制的假說。目前比較被認可的假說包括膽堿能假說、Aβ假說、Tau 蛋白假說等〔9〕。

隨著研究的進展，高通量微陣列技術與生物信息學分析相結合已被廣泛應用于預測各種疾病的潛在分子治療靶點中。本研究結果提示突觸功能在AD中發揮重要作用。突觸是大腦中記憶存儲和信息傳遞的基本單元，由突觸前部和突觸后部組成〔10〕。在AD患者大腦中各種突觸蛋白，如突觸前蛋白(SNAP)-25、突觸后蛋白(PSD)-95及突觸蛋白1和嗜鉻粒蛋白B(突觸小泡蛋白)，都在發生改變〔11，12〕。研究發現在AD動物模型中存在LTP和LTD受損及突觸傳遞缺失〔13〕。神經病理學研究表明，在輕度認知障礙(MCI)階段，突觸功能異常已很明顯〔14〕。另外，突觸功能障礙與臨床疾病的嚴重程度密切相關〔15〕。

進一步進行關鍵基因篩選獲得4個關鍵基因(SNAP25、SYP、SYT1、SYT4)均為突觸蛋白，共同參與突觸傳遞。SNAP25是一種廣泛分布的膜相關突觸前蛋白。SNAP25參與突觸小泡與質膜的對接和融合，也是可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著蛋白受體(SNARE)復合物的重要組成部分，在神經元的存活和認知中起重要作用〔16～18〕。提示SNAP25可能是反映突觸可塑性的有用生物標志物。SYP是一種突觸前囊泡膜蛋白，與神經生長、修復再生、突觸結構和功能可塑性調節有關，是突觸前特異的標志性蛋白，SYP的密度、分布間接反映突觸的數量和分布情況〔19〕。研究發現，SYP可通過神經遞質的磷酸化和釋放而影響突觸結構并在突觸可塑性中起作用，進而在AD的發展中起關鍵作用〔20，21〕。SYT1與SYT4屬于突觸結合蛋白家族，被認為是調節神經遞質釋放和腦的學習記憶等生理功能的主要蛋白之一。SYT1包含兩個Ca2+結合域C2A和C2B，且是突觸中主要的鈣傳感器之一〔22，23〕。研究發現，在AD小鼠模型和AD患者的大腦中，SYT1蛋白的表達降低，提示SYT1可能與AD中神經功能的退化有關〔24〕。目前SYT4在AD患者發病過程中的作用尚未見報道，提示可能發現了一個新的與AD發病相關的關鍵基因。