不同貯藏年份霍山石斛楓斗質量分析

戴亞峰，胡莉，王詩文，張林，縱瑞葉，黃月純，魏剛

（1.九仙尊霍山石斛股份有限公司，安徽六安 237000；2.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；4.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

霍山石斛Dendrobium huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng（D.huoshanense）為蘭科石斛屬多年生草本植物，又稱“米斛”，僅分布于安徽省霍山縣及其鄰近地區，乃石斛中的極品[1]，具有清胃除虛熱、益胃生津、厚腸胃、輕身延年、補虛羸等多種功效[2]。現代藥理學研究表明，霍山石斛具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗肝損傷、增強免疫力和抗白內障等藥理作用[3-6]，主要藥理成分包括多糖類、黃酮類、氨基酸、生物堿類及微量元素等[7]，其中多糖類和黃酮類成分是其含量最高的主要活性成分。

霍山石斛楓斗，也稱為“霍斗”“金斗”，是以霍山石斛莖為原料，經多道工序制成的彈簧狀干品，形如“龍頭鳳尾”，其工藝被列為“省級非物質文化遺產”[8]。新鮮的石斛不能長久保存，而通過加工成楓斗后石斛就不易霉爛、蟲蛀和變質。同時，由于石斛類植物的莖中黏液成分豐富，加工成楓斗后，有效成分被固化而更加穩定，不易分解。霍斗價格昂貴，對不同貯藏年份的霍斗進行主要成分分析可保障藥材的質量，為其貯藏、開發、評價等提供參考。本研究對貯藏0、2、4、6年的霍斗進行了高效液相色譜（HPLC）特征圖譜分析，同時測定夏佛塔苷、異夏佛塔苷2種主要黃酮類成分含量，并進行了多糖HPLC柱前衍生含量測定，分析貯藏時間對霍斗品質的影響，研究結果對于指導企業進行標準化生產加工以及科學貯存霍斗具有重要指導意義，現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器與試劑HP1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司，DAD檢測器）；MS-204S電子天平（d=0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；MS-105 Du電子天平（d=0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司）；乙腈、甲醇（色譜純，德國Merk公司）；其余試劑均為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 試藥夏佛塔苷對照品（批號：111912-201302；純度≥95%），中國藥品生物制品檢定院；異夏佛塔苷（批號：52012-29-0；純度≥95%），法國Extrasynthese公司；對照品D-葡萄糖（批號：110833-201506；純度≥99.9%）、D-甘露糖（批號：140651-201403；純度≥99.6%），中國食品藥品檢定研究院；D-鹽酸氨基葡萄糖（批號：RFS-Y16101912009；純度＞98%）購自成都瑞芬斯公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，批號：A1216009），阿拉丁試劑上海有限公司生產；12批（S1～S12）不同貯藏年份（0、2、4、6年各3批）霍山石斛楓斗均由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供，經廣州中醫藥大學第一附屬醫院黃月純主任中藥師鑒定為霍山石斛的楓斗加工品，見圖1。將霍斗剪碎，打粉，過4號篩（65目）。

圖1 不同貯藏年份霍山石斛楓斗外觀性狀Figure 1 External properties of D.huoshanense Fengdou after different years of storage

2 方法與結果

2.1 HPLC特征圖譜分析

2.1.1 色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相為甲醇+乙腈（A，v/v=1∶1）-0.01 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，14%～18%A；20～35 min，18%～22%A；35～45 min，22%～26%A；45～55 min，26%～30% A）。流速0.8 mL/min，柱溫40℃，檢測波長340 nm，進樣量10μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品粉末（過4號篩）1 g，精密稱定，加入80%甲醇50 mL，超聲提取1 h；取出，放冷至室溫；濾過，用適量80%甲醇洗滌濾渣；合并濾液，揮干溶劑，殘渣加60%甲醇溶解至5 mL容量瓶中；加60%甲醇定容，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液（S1）10μL，連續進樣6次。結果顯示，12個共有特征峰的相對保留時間及相對峰面積的相對標準偏差（RSD）為2.1%，表明儀器的精密度良好。

2.1.3.2 穩定性考察 精密吸取同一供試品溶液（S1）10μL，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣。結果顯示，12個共有特征峰的保留時間及相對峰面積的RSD均為1.6%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.3.3 重復性考察 取同一樣品（S1）6份，依法制備，進樣。結果顯示，12個共有特征峰的保留時間及相對峰面積的RSD均為2.7%，表明該方法重復性良好。

2.1.4 樣品的測定

2.1.4.1 共有峰的標定HPLC特征圖譜結果表明，12批霍山石斛楓斗樣品共標定12個共有峰，其中包括藥典規定的5個特征峰（峰3：夏佛塔苷；峰4：異夏佛塔苷；峰7：芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-（1→2）-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖；峰8：芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C-α-L-鼠李糖-（1→2）-β-D-葡萄糖；峰9：芹菜素-6，8-二-C-α-L-阿拉伯糖[9]）。結果見圖2。其相對保留時間與相對峰面積以峰3（夏佛塔苷）為參照峰計算。結果見表1。

表1 12批霍山石斛楓斗高效液相色譜（HPLC）特征圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積Table 1 Relative retention time and relative peak areas of common peaks in characteristic chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou by HPLC

圖2 12批霍山石斛楓斗高效液相色譜（HPLC）特征圖譜重疊圖Figure 2 Overlapping image of HPLC specific chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou

2.1.4.2 共有峰相似度分析 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）軟件進行相似度分析，以均值數法生成對照圖譜，12批樣品與對照圖譜的相似度為0.971～0.997，相似度良好，結果見表2。

表2 12批霍山石斛楓斗高效液相色譜（HPLC）特征圖譜相似度結果Table 2 Similarity results of HPLC specific chromatogram of 12 batches of D.huoshanense Fengdou

2.2 夏佛塔苷、異夏佛塔苷含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 精密度、穩定性、重復性考察 同“2.1.3.1～2.1.3.3”項。

2.2.3.2 線性范圍考察 取夏佛塔苷和異夏佛塔苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇分別制成每1 mL含夏佛塔苷28.12μg、異夏佛塔苷25.94μg的對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液各1、2、5、10、15、20、25μL，按擬定色譜條件測定峰面積。以進樣量X（μg）為橫坐標，色譜峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。夏佛塔苷的回歸方程為Y=1 858.1X-1.855 0，線性范圍為0.028 14～0.703 5μg，r=0.999 9；異夏佛塔苷的回歸方程為Y=1 894.3X-3.019 8，線性范圍為0.025 94～0.648 5μg，r=0.999 9。

2.2.3.3 加樣回收率考察 稱取6份已知含量的霍山石斛楓斗樣品（S1），每份約0.5 g，精密稱定，分別加入一定量的夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品，依法制備。進樣測定，記錄峰面積，計算得二者平均回收率分別為98.36%、101.17%，RSD均小于3%。

2.2.4 樣品的測定

2.2.4.1 對照品與樣品圖譜分析 分別取夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品溶液，混合對照品溶液以及供試品溶液（S1），按擬定色譜條件進樣分析，得到色譜圖，見圖3。

圖3 夏佛塔苷、異夏佛塔苷對照品及霍山石斛楓斗樣品（S1）高效液相色譜（HPLC）圖譜Figure 3 HPLC chromatogram of xavertaoside，isoxavertaoside controls and samples（S1）

2.2.4.2 樣品含量測定 取供試品溶液，按擬定色譜條件依法進樣分析，記錄夏佛塔苷、異夏佛塔苷峰面積，計算含量，結果見表3。5個主要特征峰相對百分含量見圖4。

表3 12批霍山石斛楓斗夏佛塔苷和異夏佛塔苷含量測定結果Table 3 Determination results of the contents of xavertaoside and isoxavertaoside in 12 batches s of D.huoshanense Fengdou

圖4 霍山石斛楓斗5個黃酮成分特征峰相對百分含量圖Figure 4 Relative percentage content of 5 characteristic peaks of flavonoid components from D.huoshanense Fengdou

2.3 D-甘露糖、D-葡萄糖HPLC柱前衍生含量測定

2.3.1 色譜條件Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相為乙腈（A）-0.02 mol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，16% A；5～17 min，16%～19% A；17～30 min，19%～22%A；30～35 min，22%～16%A）。流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長250 nm，進樣量10μL。

2.3.2 對照品與供試品溶液的制備 同文獻研究[10]的制備方法。

2.3.3 方法學考察

2.3.3.1 精密度、穩定性、重復性考察 取供試品溶液（S6），根據“2.1.3”項下方法，按擬定色譜條件進行考察。結果顯示，精密度試驗RSD為1.8%，重復性試驗RSD為2.5%，在0、2、4、8、12、24 h穩定性試驗RSD均為2.1%。

2.3.3.2 線性范圍考察 精密稱取D-甘露糖、D-葡萄糖對照品，制成0.037 5、0.075、0.15、0.3、0.75、1.5、2.25、3.0 mg/mL D-甘露糖和D-葡萄糖系列對照溶液。以對照品濃度為橫坐標X，D-甘露糖或D-葡萄糖與D-鹽酸氨基葡萄糖內標峰面積的比值（Am/As）為縱坐標Y，進行線性回歸，結果顯示：D-甘露糖的回歸方程為Y=1.003 6X-0.038 0（r=0.999 4），在0.037 5～3.00μg線性關系良好；D-葡萄糖的回歸方程為Y=0.792 8X+0.172 4（r=0.999 4），在0.037 5～3.00μg線性關系良好。

2.3.3.3 加樣回收率考察 稱取6份已知含量的霍山石斛楓斗樣品（S6），每份約0.06 g，精密稱定，分別加入一定量的對照品，依法制備，進樣測定，記錄峰面積。結果計算得D-甘露糖、D-葡萄糖平均回收率分別為101.65%、100.74%，RSD均小于3%。

2.3.4 相對校正因子的計算 取D-甘露糖、D-葡萄糖混合對照品溶液10μL，按擬定的色譜條件，分別測定D-甘露糖、D-葡萄糖、內標物的峰面積。計算校正因子f=（mi/Ai）/（ms/As），mi、Ai為被測組分的含量與峰面積。ms、As為內標物的加入量與峰面積，結果顯示：D-甘露糖、D-葡萄糖的平均相對校正因子分別為0.939 4、0.959 1，RSD分別為2.0%、1.2%。

2.3.5 樣品的測定

2.3.5.1 混合單糖對照品與樣品圖譜分析 分別取混合單糖對照品溶液與供試品溶液（S6），按照“2.3.1”項下色譜條件進樣10μL，分析得到色譜圖（見圖5）。

2.3.5.2 樣品含量測定及峰面積比值分析 記錄D-甘露糖、D-葡萄糖和內標物的峰面積，以內標法計算各樣品中D-甘露糖含量、D-葡萄糖含量，并計算兩者含量之和，以及兩者峰面積的比值（A甘/A葡）。結果見表4、圖6。

圖6 霍山石斛楓斗中D-甘露糖、D-葡萄糖以及兩糖之和含量測定結果Figure 6 Determination results of D-mannose and D-glucose contents and their sum in D.huoshanense Fengdou

表4 霍山石斛楓斗中D-甘露糖、D-葡萄糖的含量及其峰面積比值Table 4 Contents and peak area ratio of D-mannose and D-glucose from D.huoshanense Fengdou

3 討論

從外觀性狀看，12批霍山石斛楓斗無明顯差別，大小、色澤一致，表面呈黃綠色，緊湊彈簧狀，環繞緊密，莖基部和莖梢翹出，形如龍頭和鳳尾，且含水率≤8%。霍山石斛的黃酮類成分主要為黃酮碳苷，這類成分的糖基和苷元可能隨著貯存時間的增長更多地結合而含量升高[11-12]。本研究HPLC特征圖譜分析結果表明，不同貯藏年份的霍斗黃酮類成分特征峰基本一致，且相似度較高。夏佛塔苷與異夏佛塔苷含量測定結果為0.051 3～0.091 5 mg/g，含量范圍符合之前對霍山石斛鮮品的測定結果[13]，且5個特征峰相對百分含量較為一致。霍山石斛單糖主要由D-甘露糖與D-葡萄糖組成[14]，相比于誤差較大的總多糖含量測定，兩糖含量之和的測定更具有可行性，D-甘露糖與D-葡萄糖含量之和為23.87%～37.19%。此外，從D-甘露糖與D-葡萄糖峰面積之比可以看出，貯存0年和2年的霍斗兩糖比例基本相同，而貯存4年和6年的霍斗甘露糖占比更高，這可能與其鮮品的栽培方式有關。

從黃酮類成分特征峰及含量測定，以及多糖含量指標來看，貯藏6年之內的霍斗，其主要黃酮類及多糖成分均較一致，質量良好。同時提示在此種栽培技術下，霍山石斛的遺傳性穩定。不同貯藏年限霍斗主要成分含量有一定的差異，這可能與栽培年限、栽培環境、采收時間等諸多因素影響有關。此外，可進一步從揮發性成分的變化角度進行不同貯藏年份霍斗的質量分析。