亞鐵強化人工濕地去除磺胺類抗生素抗性基因

袁 濤，程 森，林子博，王 瑞，劉向群，路 平

（1.中國礦業大學力學與土木工程學院，江蘇 徐州 221000；2.江蘇建筑職業技術學院建筑裝飾學院，江蘇 徐州 221000；3.江蘇建筑節能與建造技術協同創新中心，江蘇 徐州 221000；4.中國礦業大學環境與測繪學院，江蘇 徐州 221116；5.中國礦業大學附屬醫院，江蘇 徐州 221799）

0 引 言

磺胺類抗生素是水產養殖行業常用的抗生素，可治療由微生物引起的疾病。磺胺類抗生素難以被生物完全吸收，多數會通過糞尿被排出體外[1,2]，這使得其在各類天然水體中檢出頻率較高[3,4]。殘留的抗生素會誘導微生物產生耐藥性，加劇環境中抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的污染[5,6]。ARGs 污染問題已經引起全球范圍的高度重視[7,8]，特別是在水產養殖行業中抗生素濫用的現象嚴重，如果允許未經處理或處理不當的養殖廢水排入環境，將對人體健康構成威脅。

全球多地開展了水產養殖區域ARGs 的污染調查，研究表明：水產養殖區各類ARGs豐度顯著高于非養殖區，其中磺胺類ARGs 的檢出率和相對豐度均較高[9,10]，例如芬蘭波羅海區域養殖場[11]、智利淡水鱒魚養殖區[12]、日本海水養殖區[13]、越南淡水產養殖區[14]、我國海南、廣東、天津、杭州、煙臺、太湖等地[15-17]。

傳統的污水處理技術對ARGs 的去除并不完全，出水中仍殘留大量ARGs[18,19]，亟需開展養殖廢水中ARGs的去除技術研究。但是相關研究十分有限。2013年曾報道了人工濕地去除ARGs 的可能性[20]，后又有研究發現水平潛流濕地對ARGs 的去除效率高于垂直潛流濕地，特別是對磺胺類ARGs[21,22]。

Fe2+可提高人工濕地的去除效率，例如：硫酸亞鐵可以提高垂直潛流濕地對硝酸鹽的去除率[23]。在硫酸亞鐵對人工濕地處理水產養殖廢水的影響研究中發現，當亞鐵離子添加量為20 mg/L 時，總氮（TN）、總磷（TP）、化學需氧量（COD）去除率達95%±1.9%、77%±1.2%、62%±2%[24]。同樣，在污泥硝化過程中添加氯化亞鐵可提高33.3%的ARGs 去除效果[25]。不過也有研究表明，Fe2+雖然促進了污水污泥中胞內ARGs 的去除，但也會增加污水污泥中胞外ARGs 的豐度[26]。由此可見，Fe2+對ARGs 的去除作用尚不明確，人工濕地中Fe2+對ARGs 的去除效果也尚不清楚。

因此，本研究針對水產養殖廢水中ARGs 污染問題，采集了漁業養殖廢水作為處理原水，構建了以沸石為主要填料的水平潛流人工濕地，以磺胺類抗生素的抗性c 基因sul1 和sul2及16S rRNA 為研究對象，通過熒光定量PCR 測定基因豐度，探討Fe2+對sul1，sul2 和16S rRNA 的去除作用和機制，以期為水產養殖廢水處理提供科學參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗裝置

在實驗室進行水平潛流人工濕地實驗模擬，構建四個濕地（長60 cm、寬40 cm、高40 cm）。裝置中部為濕地主填料區，長50 cm，兩端分別為進水區和出水區，長為5 cm。人工濕地中部填充粒徑為4～8 mm 的沸石，填充高度為30 cm，有效容積約30 L。在人工濕地裝置前后端的進水區與出水區，填入粒徑為10～20 mm 的礫石，填充高度為30 cm。進水區，出水區與中部填料區間設有隔板。為了促進布水均勻，在進水區上部與出水區底部的隔板上設有一排直徑5 mm 小孔。出水口設置在出水區上部。

1.2 實驗運行與樣品采集

實驗運行進水采用徐州市北郊采煤塌陷地漁業復墾塌陷地中的魚塘原水，原水樣品采集于2020年秋季。4種人工濕地進水中四水合氯化亞鐵添加量分別為0 mg/L（CW1）、20 mg/L（CW2）、40 mg/L（CW3）、80 mg/L（CW4）。人工濕地的進水水質情況如表1所示。一次配制60L 進水樣貯存于塑料桶中，為確保進水水質不變，每隔5 d 重新配制進水。采用連續進水方式，設置水力停留時間為3 d，流量約為10 L/d（BT601L 型蠕動泵），以濕地形成穩定的出水時開始計時，分別采集5、10、20、30 d的進水和出水水樣，每組實驗運行30 d。

表1 人工濕地進水水質Tab.1 Contents of conventional pollutants in the influent

1.3 樣品測試

對進水和出水水樣中常規污染物（pH、COD、TN、氨氮NH4-N、TP、總鐵）和基因（sul1、sul2 和16S rRNA）進行檢測，并進行微生物多樣性測試。

（1）常規污染物測定。樣品pH 值采用PXSJ-216F 型pH計測定，COD和NH4-N采用5B-3B(V8)型多參數水質測定儀測定，TP 采用鉬酸銨分光光度法測定，TN 采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，總鐵采用鄰菲羅啉分光光度法測定。

（2）ARGs與16S rRNA基因豐度測定。基因與微生物多樣性檢測所用水樣經0.22 μm 濾膜抽濾（SHZ-D(Ⅲ)型真空抽濾泵）后，濾膜置于滅菌離心管中，于-80 ℃下超低溫冷凍貯藏，送至上海美吉生物科技有限公司進行測序。利用FastDNA? Spin Kit for Soil (MP Biomedicals,CA,USA)試劑盒提取樣品基因組DNA。采用1%瓊脂凝膠電泳（dyy-6c型雙穩定時電泳儀）檢測DNA 樣品的質量和完整性。磺胺類ARGs（sul1 和sul2）和16S rRNA 采用熒光定量PCR（ABI7300 型，Applied Biosystems，美國）測定其絕對豐度，基因測序引物如表2所示。

表2 基因測序引物Tab.2 Gene sequencing primers

（3）微生物多樣性測定。為探究氯化亞鐵添加量對濕地進水和出水微生物群落結構的影響及ARGs去除機制，選取實驗運行5 d 的初始進水作為濕地進水樣品（CW1、CW2、CW3、CW4 進水微生物多樣性測試樣品分別命名為A1、B1、C1、D1），運行30 d 的最終出水作為濕地出水樣品（CW1、CW2、CW3、CW4 出水微生物多樣性測試樣品分別命名為A2、B2、C2、D2），共8 個樣品進行微生物多樣性檢測。PCR擴增引物采用V3-V4 區通用引物（338F/806R），引物序列分別為338F （ACTCCTACGGGAGGCAGCAG） 和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。

每個樣本進行3 次重復，取混合后的PCR 產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 產物，用Tris_HCl 洗脫，并用2%瓊脂糖電泳檢測。將PCR 產物用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統進行檢測定量，使用Illumina MiSep 平臺進行測序。提取非重復序列，降低分析中間過程冗余計算量，去除沒有重復的單序列。按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU 聚類，去除嵌合體，獲得OTU 代表序列。將優化序列map至OTU 代表序列，選出與OTU 代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU 表格。用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析，統計各樣本的群落物種組成。

2 實驗結果

2.1 基因去除效果

測算出CW1、CW2、CW3 和CW4 在不同運行時間中出水sul1、sul2與16S rRNA與實驗進水中相應值的差值，再除以實驗進水中的相應值，即可得到該人工濕地對基因的去除率。實驗結果表明，向原水中添加氯化亞鐵，能夠提高ARGs的去除效率。如圖1所示，實驗運行5 d時，4種濕地實驗對sul1的去除率較低。CW1 對sul1 的去除率僅有5.99%，添加亞鐵后，CW2、CW3 和CW4 對sul1 的去除率分別達到24.94%、48.49%、69.99%。運行10 d后，4種實驗條件下sul1的去除率出現較為明顯的增加，CW2，CW3 和CW4 對sul1 的去除率分別由CW1 的78.66%提升至85.77%、92.78%和94.53%。其后的20 d和30 d，sul1的去除效率變化不大，趨于穩定。在整個運行期間內，CW1，CW2，CW3 和CW4 對sul1 的平均去除率分別為60.62%、76.07%、82.79%和88.57%，sul1 的去除率隨著氯化亞鐵添加量的增加而提高。然而sul2 和16S rRNA 去除率并非隨著濃度提高而提高。對于sul2，當氯化亞鐵添加量為0 mg/L 或20 mg/L 時，最佳去除率出現在運行20 d 時，分別為95.79%和98.25%；當氯化亞鐵添加量為40 mg/L 或80 mg/L時，最佳去除率出現在運行30 d 時，分別為95.31% 和96.94%。對于16S rRNA，當氯化亞鐵添加量為0 mg/L 或20 mg/L 時，最佳去除率出現在運行20 d 時，分別為92.41%和95.74%；當氯化亞鐵添加量為40 mg/L 或80 mg/L 時，最佳去除率出現在運行30 d時，分別為95.88%和95.53%。

圖1 基因去除率隨時間變化情況Fig.1 Changes of genes removal rate over time

添加氯化亞鐵，改變了進水和出水中基因的絕對豐度。如圖2所示，進水中sul1 的絕對豐度高于sul2，添加亞鐵后，進水中sul1 和sul2 的絕對豐度都有升高。但相比sul1 和sul2，16S rRNA 的絕對豐度變化情況有所不同。CW3 和CW4 進水中16S rRNA 的絕對豐度有所降低。出水的變化情況表明：CW2、CW3 和CW4 中sul1 的出水絕對豐度均低于CW1，尤其是CW3和CW4，出水中sul1 的絕對豐度比CW1 降低了50%以上。然而，CW2、CW3 和CW4 出水中sul2 的絕對豐度均高于CW1，表明添加亞鐵后，實驗出水中sul2 絕對豐度升高，但隨著氯化亞鐵添加量的增加，出水sul2 絕對豐度逐漸降低，這與出水中16S rRNA 絕對豐度的變化趨勢相似。因此，綜合考慮添加氯化亞鐵，對人工濕地對基因的去除效率和絕對豐度變化，當氯化亞鐵添加量為80 mg/L 時，人工濕地實驗槽對sul1 和sul2的去除效果最優。

圖2 實驗進水和出水中基因絕對豐度變化情況Fig.2 Changes in the absolute abundance of genes in the influent and effluent

為避免測試誤差，對濕地進水和出水ARGs 的相對豐度進行了比較（ARGs的相對豐度為sul1或sul2與16S rRNA 的絕對豐度的比值）。研究發現，sul1 和sul2 相對豐度的變化趨勢與其絕對豐度基本一致。如圖3所示，CW2、CW3 和CW4 出水中sul1 的相對豐度均低于CW1；而sul2 在濕地進水和出水中的相對豐度隨著亞鐵添加量的增加而增加。

圖3 實驗進水和出水中基因相對豐度變化情況Fig.3 Changes in the relative abundance of genes in the influent and effluent

2.2 水質變化特征

添加氯化亞鐵加強了人工濕地對常規污染物的去除效果。實驗出水水質如表3所示，與最初的原水進行比較，各類污染物指標均達到排放要求，CW1 和CW2 出水TP 滿足二級排放要求，CW3 和CW4 出水TP 滿足一級排放要求，CW2、CW3 和CW4 出水TN 滿足一級排放要求。出水pH 值升高，COD、TP、TN 和NH4-N 的質量濃度降低。

表3 實驗出水水質Tab.3 Concentration of conventional pollutants in the effluent

CW1、CW2、CW3 和CW4 出水pH 值無顯著差異（P＞0.05）。實驗運行期間TP、COD、TN 和NH4-N 的去除率如圖4所示。未添加亞鐵的濕地實驗中，COD、TP、TN 和NH4-N 的平均去除率分別為42.92%、54.19%、59.01%和63.75%。添加不同劑量的亞鐵后，人工濕地對COD 的去除效果有小幅度提升，CW2、CW3 和CW4 對COD 的平均去除率分別為46.73%、50.78%和49.48%。人工濕地對TP、TN 和NH4-N 的去除率有明顯提高。CW2、CW3 和CW4 對進水TP、TN 和NH4-N 的去除率明顯提高至70.93%、75.71%和76.83%。且隨著亞鐵添加量的增加，TP 的去除率逐漸增加。CW2、CW3 和CW4 對TN的平均去除率分別提高至78.03%、75.69%和76.42%，CW2對TN的去除率最高。CW2、CW3和CW4對NH4-N的平均去除率分別提高至64.85%、69.44%和70.14%。然而，運行至20d后，CW4 對NH4-N 的去除率降低，CW3 對NH4-N 去除率最高，說明較高的氯化亞鐵投加量降低了NH4-N 的去除效果。CW1 對NH4-N 的去除率高于TN，而CW2、CW3 和CW4 對TN 的去除率高于NH4-N，說明亞鐵對TN 的去除效果提升更明顯。綜上，CW2、CW3 和CW4 對原水TP、TN 和NH4-N 的去除效果提升明顯。氯化亞鐵添加量為40 mg/L 和80 mg/L 時，TP、COD 和NH4-N 的去除率相近且較高；氯化亞鐵添加量為20 mg/L時，TN的去除率略高。

圖4 常規污染物去除率隨時間變化情況Fig.4 Changes in the removal rate of conventional pollutants over time

實驗出水中總鐵的質量濃度如圖5所示。在運行期間內，出水總鐵的質量濃度均小于1 mg/L。CW1、CW2 和CW3 出水總鐵的質量濃度逐漸降低，而CW4 出水總鐵的質量濃度先降低后逐漸升高。綜合考慮污染物去除效果和出水總鐵的質量濃度，氯化亞鐵添加量為40 mg/L 時，對常規污染物去除效果較好。

圖5 實驗出水總鐵含量Fig.5 Total iron concentration in the effluent

2.3 微生物群落結構變化特征

實驗進水和出水微生物多樣性指數如表4所示。在進水中，由Shannon 指數和Simpson 指數可知，添加氯化亞鐵后增加了進水中微生物多樣性，而隨著氯化亞鐵添加量的增加，進水微生物多樣性降低。Ace指數和Chao 1指數逐漸增加，表明細菌豐富度隨著氯化亞鐵添加量的增加而增加。在出水中，添加氯化亞鐵同樣增加了出水的微生物多樣性。而添加少量氯化亞鐵增加了出水的細菌豐富度，加大氯化亞鐵添加量，出水的細菌豐富度降低。

表4 進水和出水微生物多樣性指數表Tab.4 Microbial diversity index of influent and effluent

如圖6所示，實驗進水中放線菌門（Actinobacteria）最為優勢，在CW1、CW2、CW3 和CW4 中分別占比25.37%、38.82%、38.83% 和34.21%，其次較為優勢的有變形菌門（Proteobacteria）、異性擬桿菌門（Bacteroidota）、Patescibacteria 和藍細菌門（Cyanobacteria）等。添加氯化亞鐵后，放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）、Planctomycetota 和疣微菌門（Verrucomicrobiota）等相對豐度增加，Patescibacteria、厚壁菌門（Firmicutes）和脫硫細菌門（Desulfobacterota）等相對豐度減小。在細菌屬水平上，Norank_O_Saccharimonadales 在CW1進水中相對豐度最高，占比21.48%。而CW2、CW3和CW4中HgcI_clade 相對豐度最高，分別占比12.80%、8.40% 和12.19%。其次，相對豐度較高的有CL500-29_marine_group、Norank_F_67-14、分枝桿菌屬（Mycobacterium）等。添加氯化亞鐵后，進水中Norank_O_Saccharimonadales 相對豐度大幅降低，而HgcI_clade相對豐度增加。

圖6 實驗進水細菌組成Fig.6 Bacteria composition of influent

如圖7所示，實驗出水中變形菌門（Proteobacteria）最為優勢，隨著氯化亞鐵添加量的增加，變形菌門（Proteobacteria）占比逐漸增加。其次較為優勢的有放線菌門（Actinobacteria）、異性擬桿菌門（Bacteroidota）、Patescibacteria 和藍細菌門（Cyanobacteria）等。在屬水平上，分枝桿菌屬（Mycobacterium）、Methylotenera、Norank_F_67-14、嗜甲基菌屬（Methylophilus） 和 Norank_O_Vampirovibrionales等相對豐度較高。由此可見，添加氯化亞鐵改變了進出水中微生物群落的結構，降低了實驗出水中分枝桿菌屬（Mycobacterium）的相對豐度。CW1、CW2、CW3 和CW4 出水中分枝桿菌屬（Mycobacterium） 的占比分別為19.04%、10.86%、13.12%和4.80%。Methylotenera 和嗜甲基菌屬（Methylophilus）相對豐度隨著氯化亞鐵添加量的增加呈現升高的趨勢。

圖7 實驗出水細菌組成Fig.7 Bacteria composition of effluent

3 分析與討論

分別將進水和出水sul1、sul2 絕對豐度與pH、總鐵、COD、TP、TN 和NH4-N 的質量濃度進行冗余分析（RDA），結果如圖8所示。進水和出水中sul1 和sul2 均與常規污染物相關性較低，而與16S rRNA 相關性較高。進水16S rRNA 對sul1和sul2 的解釋度為49.3%，具有顯著影響（P＜0.05）；出水16S rRNA 對sul1 和sul2 的解釋度為59.1%，影響顯著。此外，出水總鐵的質量濃度對sul1 和sul2 的解釋度為33.9%，也具有一定影響。先前研究同樣表明sul1、sul2 與16S rRNA 顯著正相關[27,28]。ARGs 與COD、TP 和TN 等污染物間的相關性較弱，這說明Fe2+在去除ARGs 中發揮了不同于常規污染物的作用，需要從微生物水平進一步探究其去除機制。

圖8 進水和出水ARGs絕對豐度RDA分析Fig.8 RDA analysis of absolute abundance of ARGs in influent and effluent

3.1 亞鐵促進了基因轉移作用

ARGs 在環境中可進行水平轉移和垂直轉移。垂直基因轉移是在親代和子代間的轉移。嗜甲基菌屬（Methylophilus）為多重耐藥細菌[29]，軍團菌屬（Legionella） 是ARGs 潛在宿主[30]。添加氯化亞鐵后，出水中嗜甲基菌屬（Methylophilus）和軍團菌屬（Legionella）的相對豐度增加，可通過垂直轉移增加ARGs 的豐度。水平轉移是ARGs 在環境中傳播的重要途徑。質粒作為重要的可移動遺傳元件，在沒有過量誘導劑的條件下也可以高效轉移到新宿主中[31]，這一機制對磺胺類ARGs（sul1 和sul2）的傳播具有重要作用[32]。整合子與ARGs間存在正相關，對ARGs 的傳播同樣具有重要作用[33]。人工濕地對兩種磺胺類ARGs（sul1 和sul2）的去除效果存在差異，或是由于基因本身特質的不同[34]。基因sul1 通常與1 類整合子中其他ARGs 相關聯，而sul2 通常位于小的非結合質粒上或大型可傳播的多重抗性質粒[35,36]。添加氯化亞鐵后，水體pH 值降低，對ARGs 的水平轉移具有促進作用[37]。鐵的絮凝作用使微生物細胞間接觸更緊密，并增加胞外ARGs與微生物細胞的接觸，從而促進ARGs 的水平轉移[38]，進而增加進水ARGs 的相對豐度。

3.2 亞鐵促進了基質過濾作用

基質吸附和微生物去除是人工濕地去除ARGs 的主要機制，而基質吸附對ARGs 的去除作用較小，ARGs 與微生物關系密切，濕地對ARGs的去除主要依靠基質對微生物的過濾作用[39,40]。在運行初期，sul1、sul2 和16S rRNA 的去除率較低，或是因為運行初期人工濕地對微生物的過濾效果較低，隨著運行時間的增加，水體中的懸浮物和微生物等減小了基質間的間隙，從而提升了去除效果。水平潛流濕地對攜帶sul1 的細菌具有較好的去除效果[41]，分枝桿菌屬（Mycobacterium）是ARGs 的潛在宿主[30]。添加氯化亞鐵后，分枝桿菌屬（Mycobacterium）在出水中的相對豐度降低，且添加量較多時出水微生物豐富度降低，說明添加氯化亞鐵增加了濕地對sul1宿主細菌的過濾效果或抑制其生長繁殖，使得出水sul1 絕對豐度隨添加量增加而降低，并使出水sul1 的相對豐度低于進水。ARGs 可分為胞內ARGs 和胞外ARGs，胞外ARGs 豐度較高[42]，可吸附于土壤或沉積物顆粒上，以延長在環境中的持久性[43]。添加氯化亞鐵后，增加了水體中懸浮物和膠體的質量濃度，懸浮物和膠體顆粒吸附胞外ARGs使其無法穿過濾膜，進而增加了進水中sul2 的相對豐度和絕對豐度。經人工濕地處理后，大部分懸浮物被過濾，增加了ARGs的去除率。

4 結 論

研究了氯化亞鐵強化人工濕地去除sul1和sul2的效率和機制，實驗條件下主要得到以下結論，亞鐵離子促進抗性基因去除機制是多方面綜合作用的結果，還需開展更多的研究。

（1）添加氯化亞鐵，增加了人工濕地實驗槽對常規污染物和sul1的去除效果，但增加了出水中sul2的絕對豐度和相對豐度。

（2）氯化亞鐵的絮凝作用增加了人工濕地實驗槽對ARGs的過濾效果，微生物群落結構變化或促進基因轉移，增加處理體系中ARGs的豐度。

（3）亞鐵促進基因轉移和基質過濾作用是提升人工濕地去除sul1和sul2的潛在機制。