基于深度神經網絡的芯片上活體蟲黃藻檢測

周詩正，陳 琳，顏 洪，傅鵬程

（海南大學 南海海洋資源利用國家重點實驗室，海口 570100）

在海洋中，蟲黃藻與珊瑚可以形成共生關系，依靠蟲黃藻、適鹽生物與珊瑚宿主的相互結合來生活和適應不同的環境與壓力條件[1-3]。由于人類活動和氣候變化，在全球范圍頻繁發生大規模的珊瑚礁白化事件。蟲黃藻密度的變化反映蟲黃藻的光化學能力，測定蟲黃藻的種類與密度對珊瑚白化具有重要的預測意義[4]。目前，快速、準確地檢測海洋微藻細胞存在較大的局限[5]，特別是在蟲黃藻種群和計算密度的方法上。研究人員采樣后需要將樣品固定后帶回實驗室再進行檢測鑒定，固定劑加上長時間的運輸導致樣品中絕大部分藻類死亡，而無法區分正常的蟲黃藻細胞和白化珊瑚體內或游離的失去色素的蟲黃藻細胞。此外，由于藻體離開了原本的生存環境，在運輸途中易受到溫度、光照和壓強等其它因素的影響，使細胞的一些特征發生改變。被稱為“芯片上的實驗室”的微流控技術，具有微型化、集成化、高靈敏度和低成本的特點，已在單細胞研究領域引起了越來越多的關注。微流控芯片可用于微藻細胞實時檢測和環境微生物監測[6-7]，目前主要的檢測方法是在芯片上采集微藻細胞的葉綠素熒光信號[8]、電化學信號[9-10]與施加外部物理場[11]，這些方法很難對未知的和混合的微藻細胞進行分類和鑒定，因為許多亞型的甲藻細胞在外觀上只表現出微小的差異，其物理和化學性質沒有變化，而且建立電場和其他物理場對活體細胞有侵入性，不利于下游細胞分析。

深 度 學 習 神 經 網 絡 （Deep Learning Neural Network，DLNN）是人工智能領域中的一種技術架構，其已被廣泛應用于微流控芯片設計[12-13]、細胞檢測[14-16]、細胞生長分析[17-18]、藥物篩選[19]等；卷積神經網絡（Convolutional Neural Network，CNN）是 DLNN 的一種類型，更適合于圖像分析[20-21]。細胞圖像包含表型變量、細胞內部結構及細胞的分子信息，如熒光標記的基因或蛋白質[22-23]；通過神經網絡能夠對這些人眼難以識別的微妙特征，如在不同Cu2+溶液處理下微藻細胞的形態變化[24]，不同培養條件下產脂微藻細胞中的脂滴大小[25-26]等。此外，神經網絡還能將微藻細胞的光衍射信號重建為圖像以檢測細胞活力與類別[27-29]。微流控芯片技術避免了前期繁瑣的樣本處理，可以以動態的形式直接檢測水樣中的活細胞，檢測后的樣本還可以保存和進一步分析。顯微成像技術可以實時采集藻類細胞圖像數據，并利用深度學習神經網絡自動化檢測跟蹤并識別在微流控芯片中動態流動的細胞。微流控芯片與神經網絡能夠根據不同的細胞類型靈活設計，為實時檢測多種海洋微藻細胞提供了可能性。本研究結合微流控芯片技術、顯微成像技術與深度神經網絡，提出了一種基于深度神經網絡的活體蟲黃藻檢測方法，用于快速、無標簽、低成本地檢測活體蟲黃藻。

1 材料與方法

1.1 微流控芯片設計與制作在微流控芯片上設計了多個不同寬度的通道，使該芯片能夠承載不同大小與形狀的細胞的樣本溶液。每個通道具有相同的結構，由1個樣品入口、1個出口、1個聚焦微通道和1個成像區域組成。樣品入口和出口的直徑和深度分別為0.7 mm和3 mm。通過1個截面逐漸縮小的聚焦微通道，蟲黃藻細胞能夠有序地流動至成像區，避免了細胞因通道界面突然變小而導致的細胞聚集和堵塞。4個聚焦微通道的寬度分別為50 、75 、100 、125 μm，長度均為5 mm。成像區在聚焦微通道的中間，寬 300 μm，長 500 μm。微流控芯片是由標準軟光刻技術將單層聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）（Slygard184，道康寧，美國）與玻璃鍵合而成。

1.2 藻種培養與熱脅迫選用蟲黃藻作為檢測對象，從西島（海南三亞，北緯 18°14′16″，東經109°21′54″）的硬骨珊瑚Galaxea fascicularis中分離出來，通過測序鑒定，該蟲黃藻的種株為Cladocopiumsp.C1 (Symbiodiniaceae)。培養蟲黃藻所用的培養基為標準的f/2人工海水培養基。將蟲黃藻菌株的種子接種至培養基后放入恒溫光照培養箱（PGX-450D, 寧波賽福實驗儀器有限公司，中國）中培養，培養箱溫度設置為25 ℃，光照條件為200 μmol·m-2·s-1，光暗周期為 12 h∶12 h。每隔 2 d 取少許藻液，用分光光度計（ThermoSpectronic Genesys?10-S, 貝克曼庫爾特有限公司，美國）測定3次樣品在 730 nm處的光密度（OD730）并取平均值，監測液體培養中蟲黃藻細胞的生長。用血細胞計數法測量藻液密度。

采用熱脅迫的方式使蟲黃藻失活褪色。在超凈工作臺下取部分健康的蟲黃藻溶液于錐形瓶中，將錐形瓶放入恒溫光照培養箱中，培養箱溫度為 40 ℃，光照條件為 200 μmol·m-2·s-1，在該條件下對蟲黃藻進行2 h的熱脅迫。

1.3 樣品處理采用直徑為 20 μm 的 PMMA（polymethyl methacrylate）微球（東莞科邁新材料有限公司，中國）對神經網絡模型進行性能測試。微球密度為 1.19 g·cm-3，粒徑偏差小于10%。稱取6.0 g的微球，將其溶解于10 mL磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS×1，武漢賽維爾生物科技有限公司 ，中國)。取5 mL健康的蟲黃藻細胞溶液與5 mL漂白的蟲黃藻細胞溶液，用PBS緩沖液分別將兩者的細胞密度稀釋至 6×105個·mL-1。本試驗不對藻細胞溶液進行離心過濾，以保留溶液中死亡的細胞、細胞破裂碎片等雜質，模擬在野外條件采集的水體樣本，同時，這些溶液中的雜質也作為圖像中的噪聲存在，在進行神經網絡模型訓練過程中可以增加模型的魯棒性，在結果測試中雜質的存在也能更加全面地反映細胞檢測的精確度。

1.4 蟲黃藻檢測基于深度神經網絡的活體蟲黃藻檢測方法主要包括3個模塊，分別為進樣模塊、微流控模塊、數據采集與處理模塊（圖1）。進樣模塊負責控制和驅動甲藻細胞通過注射器泵進入微通道；微流控模塊承載細胞流動以進行實時的細胞圖像捕獲；數據采集與處理模塊包括1個CMOS相機與1臺微型計算機 (同方“機械革命Z2-Air”，中國)，CMOS 相機收集、傳輸藻細胞在微通道中的圖像至計算機中，通過計算機中的深度神經網絡模型對圖像中的所有目標進行定位與分類，并將預測的細胞坐標、類別與置信度實時可視化與屏幕上。檢測完成后可以通過評價指標的計算算法評價神經網絡模型的準確性。

圖1 基于深度神經網絡的活體蟲黃藻檢測方法示意圖

由于采集的芯片上圖像屬于大背景小目標圖像，因此，本研究所用的深度神經網絡在原有YOLOv4神經網絡[30]的基礎上進行了優化。優化方法包括增大圖像輸入分辨率、數據歸一化、縮放檢測框，使神經網路模型更加適用于芯片上細胞檢測。活體蟲黃藻圖像的詳細檢測流程如下：微通道中的蟲黃藻圖像被采集后重設其分辨率，輸入圖像至深度神經網絡模型，神經網絡經過逐層的上采樣提取圖像特征，由大到小生成3層特征圖；隨后進行特征尺度融合，將上層的語義信息表征能力強但分辨率低的特征圖傳遞到分辨率高但語義信息表征能力弱的下層特征圖上，使神經網絡更為準確地檢測與分割目標。模型將預測融合后的特征圖并輸出細胞的位置、類別與置信度，最后選擇置信度最高的檢測框可視化于屏幕上，做到實時的活體蟲黃藻檢測。

1.5 數據采集與模型訓練圖像采集和處理是基于1個倒置的顯微鏡成像平臺（DS-FI3，尼康，日本）。在倒置顯微鏡上安裝1個具有7.18 mm×5.32 mm視場和590萬像素的CMOS（Complementary Metal-Oxide-Semiconductor Transistor）圖像傳感器的高清相機。相機能夠以 2 880 × 2 048 像素的分辨率采集圖像，并通過USB 3.0端口傳輸，采集時的曝光時間設定為1 μs。

在 20 倍顯微鏡物鏡（CFI PlanFluor，NA= 0.45）下分別采集了600張微球、600張正常的蟲黃藻細胞和600張漂白的蟲黃藻圖像，總的圖像數據集大小為1 800張。采用LabelImg軟件以PASCAL VOC2007的格式手動標注整個數據集。將總數據集圖像和對應的標注文件進行隨機打亂，然后將其中20%用于模型訓練后的測試（微球：120張；正常蟲黃藻：120張；漂白蟲黃藻：120張），80%用于訓練和驗證（微球：480張；正常蟲黃藻：480張；漂白蟲黃藻：480張）。3個子集之間沒有重復的圖像。

1.6 評價指標神經網絡模型輸出的預測框與人為標注的真實框的交集和并集的比值稱為交并比（Intersection over Union, IoU）。IoU 的值越大說明預測框與真實框越貼合，檢測效果越好。根據IoU與預設閾值的比較，可以將圖像中的所有目標物分為3類。當神經網絡所預測的物體類別與物體實際類別相同，且IoU大于或等于預設閾值時，該預測框被標記為真陽性（True Positive，TP），這意味著該物體被神經網絡模型成功分類和定位；當神經網絡所預測的類別與實際類別不同，或是IoU小于預設閾值時，該預測框被標記為假陽性（False Positive，FP）；此外，對于同一個對象，若產生了多個預測框，且IoU均大于預設閾值，那么只有IoU最大的預測框被標記為TP，其余的框被標記為FP；其余的經過人工標注但未被檢測到的目標物被標記為假陰性（False Negative，FN）。根據TP、FP和FN的數量，神經網絡模型的性能可以用 精 確 度 （Precision, P）、 召 回 率 （Recall, R）和F1值來評估。其計算公式如下：

式中，NTP為神經網絡模型成功分類和定位的目標總數；NFP為神經網絡模型分類錯誤或定位錯誤的目標總數；NFN為神經網絡模型未能檢測到的目標總數。

某一類別的對象在不同預設閾值下的精確度和召回率的曲線下面積為平均精確度（Average Precision，AP），對所有類別的 AP值取平均值，得到 mAP（mean Average Precision）。mAP 值反映了神經網絡模型的整體檢測性能，范圍從0到100%，值越高說明模型的檢測精確度及抗干擾程度越強。

1.7 數據處理采用 Python 3.7 進行算法編寫、神經網絡模型構建和訓練與數據預處理。神經網絡訓練的過程采用TensorBoard X記錄并可視化。采用 OpenCV軟件庫與 GraphPad Prism 8.0軟件進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 蟲黃藻的不同生理狀態蟲黃藻是一種微小的單細胞甲藻，能夠進行光合作用。當蟲黃藻在正常條件下生長時，它們是黃褐色的（圖2-A）。熱脅迫后可能會變成白色（圖2-B）。在上述2種顏色之間，有一些淡褐色的蟲黃藻細胞，處于從正常生長條件到漂白狀態的過渡階段（圖2-C）。

圖2 明場顯微圖像下的蟲黃藻

2.2 蟲黃藻實時檢測將 1 mL 正常蟲黃藻溶液、2 mL漂白的蟲黃藻溶液和1 mL微球溶液充分混合，設置進樣流率為 0.20 μL·min-1，采集藻類細胞流動的視頻數據。隨機視頻中的抽取300張關鍵幀，并對每幀圖像上的目標細胞進行標注，記作實際值。隨后用訓練好的YOLOv4甲藻細胞檢測模型檢測未標注的300幀圖像上的目標細胞，檢測結果記作檢測值。對比分析檢測值與真實值的差異并計算mAP值。多目標混合溶液的檢測值與實際值如圖3所示。

圖3 多目標溶液的檢測結果與真實值

將圖3中真陽性樣本數和實際值進行對比，結果發現，在測試數據的所有目標對象上，共有19個正常蟲黃藻細胞、30個褪色蟲黃藻細胞和7和微球為未被正確地識別出來。而假陽性樣本，即模型的誤檢結果中，卻有26個蟲黃藻細胞、79個褪色的蟲黃藻細胞和7個微球。

本研究目前采用神經網絡模型在對微流控芯片通道內多類別物體檢測的mAP值為94%，如圖4所示。說明使用明場顯微圖像進行訓練的模型能夠較好地泛化至微流控芯片上蟲黃藻細胞的實際檢測上，且做到精確的檢測。正常和漂白的蟲黃藻細胞的mAP值為92%左右，說明約有8%的已被人為標注的蟲黃藻細胞未能被神經網絡模型檢測到或檢測到但定位錯誤，造成這種情況的可能原因如下：1）部分蟲黃藻細胞沒有完全漂白，呈微黃色，或者在熱應激下直接死亡，這兩種情況都使基于其算法提取蟲黃藻細胞特征的深度神經網絡模型難以解釋；2）在微流控通道中，由于細胞間距小，可能導致細胞之間保持緊密或重疊，導致檢測模型將多個細胞識別為單一細胞，導致漏檢其他細胞。

圖4 多目標檢測的 AP 值

2.3 方法對比將本研究中提出的方法（簡稱為“本方法”）與其他通過分析圖像進行微流控芯片上細胞檢測的方法對比，結果如表1所示。由于本研究采用的神經網絡檢測算法可以自動化地跟蹤定位相機視場中的每一個目標細胞，因此在溶液進樣時可無需設置額外的注射泵與通道進行鞘流聚焦。設計的芯片通道寬度約為待檢細胞的8倍，不易發生堵塞，且檢測算法可只識別想要檢測的細胞類別，具有一定的抗噪能力，因此無需前處理細胞溶液，可直接注入通道中。檢測算法將細胞分割、細胞分類與細胞定位集成在一個深度學習神經網絡模型中，可以以93.85%平均精確度實現多目標分類，但本方法還不能將檢測分類后的細胞進行精確分選，這尚需進一步完善。

表 1 本方法與其他圖像激活的微流控細胞檢測方法對比

綜上所述，與正常的蟲黃藻細胞相比，在2 h熱脅迫下漂白的蟲黃藻的藻體的形態與結構特征基本不發生改變。筆者提出的基于深度神經網絡的活體蟲黃藻檢測方法以92%精確度從兩者混合的蟲黃藻溶液中識別出正常的蟲黃藻，并且還能以94%平均精確度區分出細胞與非細胞目標，展現了基于深度神經網絡的細胞檢測方法在多種類混合微藻溶液、異質性微藻溶液乃至人體細胞上進行自動化實時快檢的潛力。

3 結 論

在對海洋微藻細胞的檢測上，往往無法做到實時性，固定劑與運輸過程中的理化因素影響將導致樣品中的部分藻類死亡，而目前的檢測手段主要通過人為鏡檢，不僅檢測結果受主觀判斷的影響大、步驟繁瑣、效率低下，而且檢測后的樣本無法進行后續的細胞分析。此外，一些自動化檢測設備存在著系統復雜龐大、價格昂貴且前處理耗時長等問題。

基于此，筆者結合了計算機視覺領域的目標檢測算法，微流控技術和顯微成像技術，實現了對不同生理階段的細胞和多類別細胞的自動檢測與分類。本實驗在明場顯微鏡下采集了微球、正常培養與熱脅迫下的蟲黃藻細胞圖像，訓練神經網絡模型并應用于微流控芯片上的細胞多分類檢測與定位。結果表明：模型對微流控芯片通道內多類別目標檢測的平均精確度可達94%，并且能夠以98%的精確度在混合樣本中區分出細胞樣本與非細胞樣本，以92%精確度檢測出細胞樣本的不同生理狀態。本方法無需在微流控芯片上添加鞘流通道且無需前處理，通過目標檢測神經網絡實現了高精度的細胞多分類與定位，不僅方便了下游的細胞分析，也為細胞分類檢測提供了新的思路與視角。