沉默circ_0007385對結腸癌細胞增殖、遷移及凋亡的影響

殷軍鋒 顧明

結腸癌是一種發生于乙狀結腸與直腸交界處的消化道惡性腫瘤，我國結腸癌發病率與死亡率逐年上升，早期診斷及治療是改善結腸癌病人預后的關鍵，因而探究結腸癌的發病機制對尋找有效的治療方法、改善病人預后意義重大[1-2]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)在結腸癌中表達異常，并可參與結腸癌發生及發展過程[3-4]。circ_0007385在非小細胞肺癌組織及細胞中表達上調，敲低其表達可抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲[5]。circ RNA Interactome預測顯示,circ_0007385與miR-485-3p存在結合位點，研究表明,miR-485-3p在結直腸癌組織中表達下調，上調其表達可抑制結直腸癌的發展進程[6]。因此，本研究主要探討circ_0007385是否可通過靶向調控miR-485-3p的表達而調節結腸癌細胞增殖、遷移及凋亡。

材料與方法

一、材料與試劑

收集2019年3月～2020年6月本院收治的43例結腸癌病人的結腸癌組織及其相應癌旁組織(>5 cm處的正常組織)標本，男23例，女20例，年齡50～68歲，平均年齡(55.36±3.26)歲。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，且入組病人或其近親屬同意使用其組織樣本。

人結腸癌細胞SW480購自上海奧陸生物科技有限公司；CCK-8試劑、凋亡檢測試劑盒、胎牛血清、胰蛋白酶、Transwell小室購自北京索萊寶；Trizol試劑、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen；反轉錄試劑、熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Fisher；miR-485-3p Inhibitor、si-NC、si-circ_0007385、miR-NC、miR-485-3p mimic、購自上海吉瑪制藥技術有限公司；兔抗人cleaved-caspase3抗體與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物。

二、方法

1.實驗分組：SW480細胞接種于6孔板(1×105個/孔)，待細胞生長融合度達到70%時進行轉染，分別稀釋si-NC、si-circ_0007385、miR-NC、miR-485-3p mimic、si-circ_0007385和miR-485-3p Inhibitor，分別記為si-NC組、si-circ_0007385組、miR-NC組、miR-485-3p mimic組、si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組。同時將正常培養的SW480細胞記為control組。

2.qRT-PCR檢測circ_0007385、miR-485-3p的表達水平：采用Trizol試劑分別提取癌旁組織(43例)、結腸癌組織(43例)與各組SW480細胞總RNA，測定RNA濃度后。反轉錄合成cDNA，將cDNA、上下游引物與實時qRT-PCR預混液混合進行qRT-PCR反應。應用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測circ_0007385、miR-485-3p相對表達量。

3.雙熒光素酶報告實驗檢測circ_0007385與miR-485-3p的靶向關系：將WT-circ_0007385與miR-NC、WT-circ_0007385與miR-485-3p mimic、MUT-circ_0007385與miR-NC、MUT-circ_0007385與miR-485-3p mimic分別共轉染SW480細胞，培養24 小時后，檢測細胞熒光素酶活性。

4.CCK-8實驗檢測細胞增殖：收集各組SW480細胞以1×104個/孔的密度接種96孔板，分別于培養24、48、72 小時分別加入10 μl CCK-8溶液，于培養箱培養2 小時后用酶標儀檢測各孔吸光度值(OD 450 nm)。

5.平板克隆形成實驗：取各組SW480細胞接種于6孔板(1×103個/孔)，于37℃、5% CO2體積分數培養箱14 天后棄培養基，加入4%多聚甲醛固定20 分鐘，0.1%結晶紫染色5 分鐘，PBS洗滌后晾干，于顯微鏡下統計直徑大于0.1 mm的細胞克隆形成數。

6.劃痕實驗：取各組SW480細胞接種于6孔板(1×104個/孔)，待細胞長滿后用200 μl移液管槍頭劃下細胞，于顯微鏡下拍照(0 小時)，繼續培養24 小時后于顯微鏡下拍照(24 小時)，應用ImageJ軟件檢測劃痕寬度并計算劃痕愈合率[(0 h小時劃痕寬度-24 小時劃痕寬度)/0 小時劃痕寬度×100%]。

7.Transwell實驗檢測細胞遷移：取各組SW480細胞(1×105個/ml)加入小室的上室(200 μl/孔)，取600 μl完全培養液加入下室，于培養箱內培養24 小時。多聚甲醛固定穿膜細胞20 分鐘，0.1%結晶紫染色10 分鐘，顯微鏡下觀察遷移情況，細胞遷移數以隨機3個視野染色細胞數的均值表示。

8.流式細胞術檢測細胞凋亡率：預冷PBS洗滌各組SW480細胞，3 000 r/min離心6 分鐘，向細胞沉淀中加入500 μl結合緩沖液，重懸后按照凋亡試劑盒說明書操作并應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

9.Western blot檢測cleaved-caspase3蛋白表達量：取各組SW480細胞加入蛋白裂解液提取總蛋白，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100 ℃孵育10 分鐘，電泳反應后將蛋白質轉移至PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白封閉PVDF膜1 小時，加入內參GAPDH抗體(1∶2 000)、cleaved-caspase3一抗(1∶1 000)稀釋液，4 ℃孵育24 小時，室溫下加入二抗(1∶5 000)稀釋液孵育2 小時。ECL發光液作用后顯影，ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

三、統計學分析

結果

1.circ_0007385和miR-485-3p表達的檢測：結腸癌組織中circ_0007385的表達量高于癌旁組織(P<0.05)，miR-485-3p的表達量低于癌旁組織(P<0.05)，見圖1A～B。采用Pearson法分析結腸癌組織中circ_0007385、miR-485-3p表達量的相關性，結果顯示，circ_0007385與miR-485-3p呈負相關(r=-0.972，P<0.001)，見圖1C。si-circ_0007385組circ_0007385的表達量低于control組和si-NC組(P<0.05)，見圖1D。與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組miR-485-3p的表達量升高(P<0.05)；與control組、miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組miR-485-3p的表達量升高(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組miR-485-3p的表達量降低(P<0.05)，見圖1E。

A：結腸癌組織中circ_0007385高表達；B：結腸癌組織中miR-485-3p低表達；C： circ_0007385和miR-485-3p負相關；D：circ_0007385表達的檢測；E：miR-485-3p表達的檢測注：與control組相比，aP<0.05；與si-NC組相比，bP<0.05；與miR-NC組相比，cP<0.05；與si-circ_0007385組相比，dP<0.05N：癌旁組織；C：結腸癌組織(43例)圖1 circ_0007385和miR-485-3p表達的檢測

2.circ_0007385和miR-485-3p靶向關系的驗證：circ RNA Interactome預測顯示circ_0007385與miR-485-3p存在互補序列，見圖2。miR-485-3p過表達可降低WT-circ_0007385的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-circ_0007385的熒光素酶活性，見圖2B。表明circ_0007385與miR-485-3p存在靶向關系。

圖2 circ_0007385和miR-485-3p互補序列及熒光素酶活性檢測

3.同時抑制circ_0007385和miR-485-3p對SW480增殖的檢測：與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組細胞活力降低(P<0.05)，集落形成數減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組細胞活力降低(P<0.05)，集落形成數減少(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組細胞活力升高(P<0.05)，集落形成數增多(P<0.05)，見表1。

表1 各個處理組細胞活性和集落形成數的檢測

4.同時抑制circ_0007385和miR-485-3p對SW480遷移的檢測：與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組劃痕愈合率降低(P<0.05)，遷移細胞數減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組劃痕愈合率降低(P<0.05)，遷移細胞數減少(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組劃痕愈合率升高(P<0.05)，遷移細胞數增多(P<0.05)，見表2。

表2 各個處理組細胞遷移能力的檢測

5.同時抑制circ_0007385和miR-485-3p對SW480凋亡的檢測:與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 各個處理組細胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達的檢測

討論

circ_0007385在非小細胞肺癌組織和細胞系中表達較高，并且與較差的總生存期相關，沉默circ_0007385可抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲[8]。但circ_0007385在結腸癌中的表達尚未可知。

本研究結果顯示，結腸癌組織中circ_0007385的表達量升高，體外細胞實驗證實，沉默circ_0007385后結腸癌細胞活力降低，集落形成數與遷移細胞數減少，劃痕愈合率降低。研究表明caspase3屬于凋亡執行因子，其被激活后可誘導細胞凋亡[9-10]。本研究結果顯示，沉默circ_0007385后結腸癌細胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高，提示沉默circ_0007385可促進結腸癌細胞凋亡。表明circ_0007385高表達可抑制結腸癌細胞凋亡，促進細胞增殖、遷移，從而參與結腸癌發生發展過程。

為進一步探究circ_0007385在結腸癌發生及發展過程中的作用機制，本研究證實circ_0007385基因序列上包含miR-485-3p的結合位點。研究表明，miR-485-3p在腎癌組織和細胞中表達水平降低，上調其表達可抑制腎癌細胞增殖、遷移及侵襲[11]。miR-485-3p在膠質母細胞瘤中呈低表達，上調其表達可抑制膠質母細胞瘤細胞增殖及遷移[12]。miR-485-3p在結直腸癌中表達下調，miR-485-3p過表達可靶向程序性細胞死亡受體配體1(PDL1)表達而抑制結直腸癌細胞增殖及轉移并可促進細胞凋亡[13]。miR-485-3p高表達可抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移[14]。本研究結果顯示，結腸癌組織中miR-485-3p的表達量降低，circ_0007385與miR-485-3p呈負相關，miR-485-3p過表達可促進結腸癌細胞凋亡，抑制其增殖、遷移能力，而抑制miR-485-3p表達可逆轉沉默circ_0007385對結腸癌細胞增殖、遷移及凋亡的作用。提示circ_0007385可通過靶向調控miR-485-3p的表達而參與結腸癌發生及發展過程。

綜上所述，結腸癌組織中circ_0007385的表達水平升高，miR-485-3p的表達水平降低，circ_0007385與miR-485-3p呈負相關且circ_0007385可靶向結合miR-485-3p，沉默circ_0007385可通過上調miR-485-3p表達而促進結腸癌細胞凋亡，抑制其增殖和遷移，circ_0007385/miR-485-3p可能作為結腸癌診斷的潛在生物學標志物及其治療的潛在靶點。但circ_0007385基因序列上富含多個miRNA的結合位點，其是否可通過靶向調控其他miRNA而參與結腸癌發生及發展過程尚需進一步探究。