血清外泌體miR-22-3p與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情嚴(yán)重程度的關(guān)系研究*

龐琳烜，楊西超，李治琴，杜望磊

（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床免疫科，西安 710032）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種常見病，致殘率較高[1]，其早期診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查。該病臨床表現(xiàn)多樣，檢查指標(biāo)的靈敏度較低，限制了對(duì)該病的早期診斷，延誤了最佳治療時(shí)間，不利于患者預(yù)后[1]。外泌體是直徑為40～100 nm的盤狀囊泡，來(lái)源于細(xì)胞溶酶體微粒內(nèi)陷形成的囊泡，被釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)狀RNA等，可參與多種生物學(xué)過(guò)程[2]。其中miRNA 是一類長(zhǎng)度為20～24 個(gè)核苷酸的小RNA，在外泌體中穩(wěn)定存在，可隨著外泌體循環(huán)被遠(yuǎn)處或鄰近細(xì)胞所攝取，參與多種病理生理過(guò)程[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血中有多種miRNA 呈異常表達(dá)，miRNA 對(duì)心血管疾病、腎臟疾病、腫瘤等有一定的臨床診斷價(jià)值[4-5]。miR-22-3p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)及意義鮮少報(bào)道。有研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿及外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-22-3p表達(dá)水平升高[6-7]。本研究從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血中提取外泌體，探討血清外泌體miR-22-3p與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情嚴(yán)重程度的關(guān)系及其早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020 年12 月至2021 年12 月空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者100例（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組），其中處于活動(dòng)期64 例，緩解期36 例；男39 例，女61 例；年齡38～71 歲，平均（53.19±3.08）歲；體重指數(shù)（21.12±2.01）kg/m2。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；（2）年齡≥18 歲；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）急慢性感染性疾??；（2）腫瘤；（3）免疫缺陷；（4）代謝性疾病。另選取同期在本院行體格檢查的健康志愿者100例為對(duì)照組，其中男42例，女58例；年齡35～68 歲，平均（52.09±4.11）歲；體重指數(shù)（21.56±2.33）kg/m2。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清外泌體的分離和鑒定 采集患者晨起空腹肘靜脈血1 mL，2 000 r/min 離心15 min，留取血清，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。用外泌體提取試劑盒（西安齊岳生物科技有限公司）提取血清外泌體。取10 μL外泌體加于銅網(wǎng)上，沉淀1 min。加入10 μL 2%醋酸雙氧鈾于銅網(wǎng)上沉淀1 min。常溫下干燥15 min，隨后用JEM-2100F 透射電子顯微鏡（上海研酷檢測(cè)中心）觀察。

用Western blotting 法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物TSG101 和CD63 的蛋白表達(dá)[9]。用RAPI裂解液提取總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度；10% SDSPAGE 電泳分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜；5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗TSG101（1∶10 000，美國(guó)Sigma 公司）、CD63（1∶200，美國(guó)Sigma 公司）4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，用TBST 緩沖液洗膜3 次后加入二抗，室溫下孵育2 h，ECL 發(fā)光儀進(jìn)行蛋白成像。

1.2.2 紅細(xì)胞沉降率（ESR）和C反應(yīng)蛋白（CRP）檢測(cè) 用免疫酶化學(xué)發(fā)光儀（法國(guó)梅里埃公司）檢測(cè)ESR 和CRP，ESR 的檢測(cè)用魏氏法，CRP 的檢測(cè)用免疫比濁法。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)外泌體miR-22-3p表達(dá)水平 用Trizol 法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用熒光定量試劑盒（西安齊岳生物科技有限公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，用2-△△CT法計(jì)算miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量。引物序列：miR-22-3p上游5’-GGCGATCATACTGGGAGATG-3’，下游5’-TGTGATTCAAGTTGGGGTCA-3’；內(nèi)參U6上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.2.4 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎Steinbrocker 影像學(xué)分級(jí)及病情活動(dòng)度評(píng)分 根據(jù)手與腕部X 線檢查，進(jìn)行Steinbrocker分級(jí)[10]：（1）I級(jí)：正?；蛘呖赡艽嬖诠琴|(zhì)疏松；（2）Ⅱ級(jí)：骨質(zhì)疏松伴有軟骨下骨質(zhì)破壞，輕度關(guān)節(jié)間隙狹窄；（3）Ⅲ級(jí)：明顯關(guān)節(jié)面下骨質(zhì)破壞、關(guān)節(jié)變形、關(guān)節(jié)間隙狹窄，但無(wú)纖維性或者骨性強(qiáng)直；（4）Ⅳ級(jí)：除Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)表現(xiàn)外，伴有纖維性或者骨性強(qiáng)直。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度評(píng)價(jià)表（DAS28）[11]：疾病緩解為＜2.6 分；低活動(dòng)度為2.6～3.2分；中度活動(dòng)度為＞3.2分且≤5.1分；高活動(dòng)度為＞5.1分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；兩組獨(dú)立樣本間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析用Pearson檢驗(yàn)。用受試者工作特征曲線（ROC）分析血清外泌體miR-22-3p 診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的價(jià)值，計(jì)算曲線下面積（AUC）、靈敏度和特異度。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體的鑒定

顯微鏡下可觀察到外泌體呈囊泡狀，直徑約為40～100 nm（圖1 白色箭頭所示）。Western blotting實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)到外泌體標(biāo)志物TSG101及CD63（圖2）。

圖1 透射電子顯微鏡觀察外泌體（×50 000）

圖2 Western blotting法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物TSG101及CD63

2.2 兩組血清外泌體miR-22-3p表達(dá)水平比較

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組血清外泌體miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量為（1.78±0.34），高于對(duì)照組的（0.72±0.21）（P＜0.05）。ROC 曲線顯示：血清外泌體miR-22-3p診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的AUC為0.82，診斷最佳臨界值為1.54，靈敏度和特異度分別為82.39%和74.15%，見圖3。

圖3 血清外泌體miR-22-3p診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的ROC曲線

2.3 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)水平與Steinbrocker分級(jí)、病情活動(dòng)度的關(guān)系

Steinbrocker Ⅳ級(jí)患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)量為（2.03±0.71，n=32）、Ⅲ級(jí)為（1.79±0.45，n=40）、Ⅱ級(jí)為（1.53±0.23，n=28），分級(jí)越高，表達(dá)水平越高（F=19.347，P＜0.001）?；顒?dòng)期患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)量為（2.10±0.45，n=64），高于緩解期患者的（1.45±0.30，n=39）（P＜0.05）。重度活動(dòng)度患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)量為（2.40±0.76，n=26），中度活動(dòng)度為（2.00±0.38，n=20），輕度活動(dòng)度為（1.89±0.21，n=18），活動(dòng)度越高，表達(dá)水平越高（F=8.564，P=0.002）。

2.4 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)水平與ESR、CRP的關(guān)系

血清外泌體miR-22-3p 分別與ESR、CRP 呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.307，r=0.370，P＜0.05），見圖4。

圖4 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)水平與ESR、CRP的相關(guān)性分析

3 討論

miR-22-3p在腎臟損傷[12]、高血壓[13]、心肌梗死[14]和癌癥[15]等多種疾病中有異常表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎組血清外泌體中miR-22-3p 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，與既往研究結(jié)果相一致[7]；ROC 曲線分析顯示，血清外泌體miR-22-3p 對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定的診斷價(jià)值。本研究結(jié)果提示miR-22-3p表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展，可能與miR-22-3p 介導(dǎo)免疫炎癥損傷有關(guān)[16]。

ESR、CRP 與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情活動(dòng)度有關(guān)[17]。本研究中，活動(dòng)期患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)量高于緩解期患者。患者活動(dòng)度越高，血清外泌體miR-22-3p 表達(dá)水平越高。另外，血清外泌體中miR-22-3p表達(dá)水平與ESR、CRP表達(dá)水平有關(guān)，表明外泌體中miR-22-3p可以作為評(píng)估類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情活動(dòng)性的參考指標(biāo)。本研究采用Steinbrocker 影像學(xué)分級(jí)對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，Steinbrocker分級(jí)越高，患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)水平越高。說(shuō)明血清外泌體miR-22-3p可評(píng)估關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)展。以上結(jié)果說(shuō)明血清外泌體miR-22-3p可能作為監(jiān)測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)性、判斷影像學(xué)進(jìn)展的指標(biāo)。

本研究也存在一些局限性：（1）本研究檢測(cè)了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清外泌體miR-22-3p表達(dá)水平及臨床意義，但是未分析其作用機(jī)制，未來(lái)需要開展細(xì)胞及動(dòng)物研究進(jìn)行探討；（2）未對(duì)患者進(jìn)行隨訪，外泌體miR-22-3p 與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病情動(dòng)態(tài)變化的關(guān)系需要未來(lái)進(jìn)行研究；（3）本研究顯示外泌體miR-22-3p對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有一定診斷價(jià)值，但是如何進(jìn)一步提高靈敏度和特異度仍需研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清外泌體miR-22-3p 表達(dá)水平升高，對(duì)疾病早期診斷有一定價(jià)值。血清外泌體miR-22-3p與疾病活動(dòng)性和影像學(xué)進(jìn)展相關(guān)，可能成為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生物學(xué)指標(biāo)。未來(lái)需要深入探討miR-22-3p在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生及發(fā)展中的機(jī)制。