胡椒堿對番茄灰霉病菌抑制作用及其機理研究

包 華 李 康 鐘睦琪 郝智慧*

(1.青島農業大學 化學與藥學院，山東 青島 266109； 2.中國農業大學 動物醫學院/中獸醫創新中心，北京 100193)

番茄是世界上種植面積第二大的蔬菜，也是我國重要的經濟作物。番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(

Botrytis

cinerea

)侵染引起的一種世界性番茄病害，其傳播速度快且危害重，是番茄上發生最嚴重且最頻繁的病害。該病主要危害果實，造成果實腐爛，也可危害葉、莖和花，極大影響了番茄產量，嚴重時可減產20%～30%，給農戶帶來巨大的經濟損失。

近年來，番茄灰霉病以化學藥劑防治為主，不僅污染環境，而且易使病菌產生抗藥性，導致防效降低。植物源農藥是國內外新農藥研發熱點之一。植物源農藥取材于植物中的天然活性成分，在自然環境中可被有效降解，同時可以有效殺死或有效抑制病原菌的生長，其種類繁多、資源豐富，并且無殘留，低毒或無毒，不易使病原菌產生抗性。植物源農藥結構類型涉及萜類、生物堿類、黃酮類、醌類、酯類、酚類、醛類、醇類、甾類、有機酸及精油類等化合物。

目前，國內外有關植物體內生物堿化合物的分離及抑菌作用研究較多，相關報道也證明了生物堿對植物病原菌具有顯著的抑制作用。如小檗堿能抑制水稻細菌性條斑病菌的正常生長，并使其致病力降低；0.5%苦參堿水劑防治蘋果樹腐爛病效果優異，明顯優于市場上常用的40%福美砷；胡椒堿的類似物蓽茇寧酰胺對枯草芽孢桿菌具有很強的抑制活性。

胡椒堿是胡椒科植物特有的一種生物堿，具有良好的抗炎和抗菌作用，如黑胡椒石油醚提取物可破壞大腸桿菌以及金葡萄球菌細胞壁和細胞膜結構，從而達到抑菌效果。但胡椒堿對植物病原菌抑制效果的研究鮮有報道，本研究通過測定胡椒堿對番茄灰霉病菌抑菌活性，以及從顯微結構、細胞膜通透性和酶活性等方面探究胡椒堿對番茄灰霉病菌的作用機理，以期為胡椒堿的田間利用及植物源農藥的研制開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

番茄灰霉病菌由青島農業大學綠色農藥研究所提供，于4 ℃條件下保存。將保存的菌種轉接到培養平板上進行活化，置于26 ℃恒溫培養箱中培養至菌絲長滿整個平板，用打孔器沿菌落外緣打取直徑為5 mm的菌餅備用。

胡椒堿(Piperine，純度≥98%)購于上海麥克林生物科技有限公司，PDA培養基、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒、NAD-蘋果酸脫氫酶(NAD-MDH)試劑盒、考馬斯亮藍(G-250)和牛血清白蛋白(BSA)購于北京索萊寶有限公司，二甲基亞砜(DMSO)和葡萄糖購于國藥化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

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2

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胡椒堿溶液的配制

準確稱取胡椒堿20 mg，用DMSO溶解，配置成20 000 mg/L的胡椒堿儲備液。

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2

番茄灰霉病菌抑菌活性和產孢量的測定采用生長速率法測定胡椒堿對番茄灰霉菌的抑菌活性。將配置好的儲備液添加到PDA培養基(約50 ℃)中，配置成質量濃度分別為200.0、150.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L的含藥培養基，搖勻后倒平板；以添加相同濃度的百菌清為陽性對照，以添加相同劑量(200.0 μL)的DMSO的培養基作為陰性對照(CK)，在培養基中央接種

d

=5 mm經純培養的番茄灰霉菌菌絲圓片，26 ℃恒溫培養。4 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制生長率，每處理3次重復。采用濃度對數-抑制率概率值法求取毒力回歸方程及半數效應濃度(EC)。將番茄灰霉病菌接種在PDA培養基上，26 ℃恒溫培養7 d，待對照產生大量分生孢子后，用無菌水洗脫孢子，配置成孢子懸浮液，計算產孢抑制率。計算公式如下：

抑制率=

(1)

產孢抑制率

(2)

1

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2

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3

番茄灰霉病菌孢子萌發的測定

番茄灰霉病菌培養7～8 d后使其產孢，加無菌水配制成孢子懸浮液數量為1×10CFU/mL，在凹玻片上加入與1.2.2相同質量濃度的胡椒堿，26 ℃黑暗條件下培養12 h后，計算孢子萌發率。

孢子萌發率

(3)

1

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2

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4

番茄灰霉病菌菌絲形態測定

配置質量濃度為25.0、50.0和100.0 mg/L的PDA培養基。在平皿中央接種番茄灰霉病菌，在菌落邊緣斜插蓋玻片，待菌絲長到蓋玻片上，取出，通過掃描電鏡觀察菌絲形態并進行比較。

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2

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5

番茄灰霉病菌菌體可溶性蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍G-250染色法測定菌絲可溶性蛋白含量。

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番茄灰霉病細胞膜通透性的測定

采用電導率法，將PDB培養液中的菌絲培養3 d，于對數生長期取出，用超純無菌水沖洗4次，用濾紙吸干水分。稱取1.5 g菌絲均分為6份，分別加到質量濃度為200.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L含胡椒堿溶液的去離子水和對照組中，對照組加上等量的去離子水，在環境條件為25 ℃時分別測定0、1、2、3、4、5和6 h電導率。根據電導率變化，觀察胡椒堿對細胞膜通透性的影響。

1

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2

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7

番茄灰霉病菌菌體相關酶(SOD、CAT、POD、SDH和NAD

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MDH)活性測定

按照1.2.6取菌絲方法，將菌絲冰浴研磨成勻漿后離心，取得上清液為粗酶液，將粗酶液(菌絲)按照參考文獻[19]方法進行操作，加入所需試劑。SOD酶活性測定將560 nm吸光度下以黃嘌呤氧化酶偶聯反應體系中抑制百分率為50%時定義為 1個活力單位，CAT酶活性測定將240 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘減少0.01吸光度定義為1個活力單位，POD酶活性測定將470 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘增加0.01吸光度定義為1個活力單位，SDH酶活性測定將600 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘使反應體系吸光度降低0.01為1個活力單位，NAD-MDH酶活性測定將340 nm吸光度下每毫克蛋白每分鐘使反應體系吸光度降低0.01為1個活力單位。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2007和Graphpad進行數據統計和繪圖，利用SPSS 19.0進行數據的方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌生長的抑制作用

不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌的抑菌活性測定結果見表1。毒力回歸方程為

y

=3.849 6+0.904 2

x

，相關系數

R

≥0.95。試驗結果表明，不同質量濃度的胡椒堿對番茄灰霉病抑制效果顯著差異，隨著質量濃度的增加抑菌率也在增加，呈劑量依賴性。當胡椒堿質量濃度為200.0 mg/L時，其抑菌率為80.61%。胡椒堿對番茄灰霉病菌菌絲生長EC為18.72 mg/L，其置信限為8.30～42.24 mg/L。陽性對照藥物百菌清對番茄灰霉病菌EC為20.65 mg/L，由此可見胡椒堿對番茄灰霉病菌的抑制效果優于百菌清對番茄灰霉病菌的抑制效果。

表1 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌的抑菌活性
Table 1 Antifungal activity of piperine against with different mass concentrations

質量濃度/(mg/L)Mass concentration質量濃度對數Mass concentrationlogarithm菌落直徑/cm Colony diameter123平均值抑制率/%Inhibition rateEC50/(mg/L)05.755.705.765.7412.51.093.553.453.373.4643.5325.01.402.903.03.062.9952.4950.01.702.132.262.42.2666.3218.72100.02.001.571.631.791.6677.87150.02.181.601.611.651.6278.63200.02.301.501.531.521.5280.61

2.2 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌孢子產量的影響

胡椒堿對番茄灰霉病菌孢子產量抑制結果見圖1。不同質量濃度的(200.0、150.0、100.0、50.0、25.0和12.5 mg/L)胡椒堿處理番茄灰霉病菌后，孢子數量分別為3.04×10、5.62×10、7.20×10、13.58×10、18.00×10和21.38×10cfu/mL，對應的孢子產孢抑制率分別為88.30%、78.36%、72.27%、47.75%、30.77%和17.79%，孢子產孢量EC為45.11 mg/L。與CK對比，產孢量顯著下降。上述結果表明，胡椒堿對番茄灰霉病菌產孢量具有明顯抑制效果，且質量濃度越大，抑制效果越好。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。 Different letters represent significant differences (P<0.05), while the same letters represent no significant differences (P>0.05). The same below.圖1 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌孢子產生的影響Fig.1 The effect of different mass concentrations of piperine on the spore production of B. cinerea

2.3 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌孢子萌發的影響

載玻片萌發法測定番茄灰霉病菌孢子萌發結果表明(圖2)，隨著胡椒堿質量濃度的增加，對孢子萌發的抑制作用增強。胡椒堿質量濃度在200.0 mg/L下，孢子萌發率為16.92%，孢子萌發抑制率高達88.81%。高質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌孢子萌發具有較強的抑制效果，胡椒堿對孢子萌發EC為38.86 mg/L。

2.4 胡椒堿對番茄灰霉病菌超微結構的影響

通過掃描電鏡觀察，不同質量濃度胡椒堿處理的番茄灰霉病菌菌絲形態與對照相比存在明顯差異。對照組菌絲粗細均勻、形態規則(圖3(a))；處理組菌絲變細、節間拉長、菌絲干癟和坍塌(圖3(b)～(d))。

2.5 胡椒堿對番茄灰霉病菌菌絲體可溶性蛋白含量的影響

采用胡椒堿處理后的番茄灰霉病菌菌絲體(表2)可溶性蛋白含量隨著胡椒堿質量濃度的升高呈降低的趨勢，說明胡椒堿影響了可溶性蛋白的合成或是破壞了細胞膜結構從而造成可溶性蛋白流失。

圖2 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌孢子萌發的影響Fig.2 The effect of different mass concentrations of piperine on spore germination of B. cinerea

2.6 胡椒堿對番茄灰霉菌體細胞膜滲透性的影響

采用電導率法測定了胡椒堿對番茄灰霉菌體細胞膜滲透性的影響，結果如圖4所示。未經胡椒堿處理的菌液(CK組和DMSO組)電導率在作用1～6 h內基本沒有變化，經胡椒堿處理后的菌液電導率均有不同程度的變化。當胡椒堿作用時間超過2 h時，隨著胡椒堿質量濃度的增大，電導率也隨之增大；作用時間相同時，胡椒堿質量濃度越大，相應菌液的電導率也越大。說明經胡椒堿處理后的番茄灰霉病菌菌絲細胞膜受到損傷，細胞內的小分子如Na、K和Ca等離子外漏，導致電導率發生變化。

2.7 胡椒堿對番茄灰霉病菌菌體酶活系統的影響

2

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7

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1

胡椒堿對番茄灰霉病菌抗氧化酶(SOD、CAT和POD)相關活性的影響

胡椒堿對番茄灰霉病菌菌體SOD、CAT和POD酶活性的影響如圖5所示。從圖中可以看出，經200.0、100.0、50.0和25.0 mg/L胡椒堿處理的番茄灰霉病菌菌體SOD、CAT和POD酶活性均顯著低于對照組，且菌體SOD、CAT和POD酶活性隨著胡椒堿質量濃度增加呈現下降趨勢。說明胡椒堿抑制了番茄灰霉病菌菌體內抗氧化酶系統活性，導致菌體內活性氧離子不能被及時清除，從而達到抑菌效果。

2

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7

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2

胡椒堿對番茄灰霉菌體SDH和NAD

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MDH酶相關活性的影響

胡椒堿對番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活性的測定結果如圖6所示。經200.0、100.0、50.0和25.0 mg/L胡椒堿處理的番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活性均顯著低于對照組，

圖3 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌菌絲形態的影響Fig.3 The effect of different mass concentrations of piperine on the hyphae morphology of B. cinerea

表2 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌菌絲體 可溶性蛋白含量的影響
Table 2 The effect of different mass concentrations of piperine on the soluble protein of

質量濃度/(mg/L)Massconcentration可溶性蛋白質量分數/(mg/g)Soluble protein massconcentration抑制率/%Inhibitionrate03.617±0.100 a-12.53.291±0.070 a9.0225.02.875±0.090 b20.5250.02.756±0.160 b23.79100.02.132±0.010 c41.05200.01.191±0.080 d67.06

注：同列數據不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Note: Within the same column, different letters represent significant differences (<0.05).

圖4 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌 細胞膜通透性的影響Fig.4 The effect of different mass concentrations of piperine on the cell membrane permeability of B. cinerea

且菌體SDH和NAD-MDH酶活性隨著胡椒堿質量濃度增加呈現下降趨勢。SDH和NAD-MDH酶是三磷酸循環中2種重要的氧化還原酶，胡椒堿通過降低番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活力，從而抑制菌體內的能量代謝，最終抑制菌體生長。

圖5 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌抗氧化酶活性的影響Fig.5 The effect of different mass concentrations of piperine on the activity of antioxidant enzymes of B. cinerea

圖6 不同質量濃度胡椒堿對番茄灰霉病菌SDH和NAD-MDH酶活性的影響Fig.6 The effect of different mass concentrations of piperine on the enzyme activities of SDH and NAD-MDH of B.cinerea

3 討論與結論

目前，胡椒堿及其衍生物對植物病原真菌的研究主要集中在抑菌活性方面，但胡椒堿對植物病原真菌抑菌機理尚不明確。基于此，本研究通過胡椒堿對番茄灰霉病菌抑菌機理展開研究，進而確定抑制靶點。本研究結果表明，胡椒堿對番茄灰霉病菌菌絲孢子的產生和萌發均具有強烈的抑制作用，胡椒堿可造成菌絲生長畸形，并使其產孢能力、芽管長度和孢子萌發率下降。這與張新虎等研究的蒼耳提取物對孢子和菌絲的抑制作用結果一致，表明胡椒堿中可能含有能抑制孢子和菌絲呼吸作用的活性物質，并通過抑制孢子和菌絲的呼吸而實現抑菌作用。可溶性蛋白作為重要的滲透調節物質和營養物質，對細胞的生命物質及生物膜起到保護作用，其含量變化是衡量生物活性的一個重要的生理指標。本研究發現，番茄灰霉病菌經胡椒堿處理后菌液電導率上升，說明其細胞膜滲透性發生改變。進一步測定番茄灰霉病菌可溶性蛋白含量發現，胡椒堿處理后番茄灰霉病菌的可溶性蛋白含量出現明顯下降，表明胡椒堿主要通過抑制可溶性蛋白的合成，致使細胞膜受損而導致菌絲死亡。

抗氧化酶作為細胞內重要的保護酶系廣泛分布于生物體內，通過分工協作共同清除細胞內活性氧類。SOD酶可以把有害的超氧自由基轉化為過氧化氫，盡管過氧化氫仍是對機體有害的活性氧，但體內的CAT酶和POD酶會立即將其分解為完全無害的水。只有3種酶共同協作才可組成一個完整的防氧化鏈，但目前研究中僅少數藥物可同時對這3種抗氧化酶產生抑制效果。周杰辰等研究表明黃檀炭疽病菌經垂序商陸與勝紅薊乙酸乙酯提取物處理后，SOD酶活力降低，CAT酶活力升高。本研究通過胡椒堿處理番茄灰霉病菌菌體后，菌體SOD、POD和CAT酶活性均顯著下降，與周杰辰等研究結果不同。表明胡椒堿可通過抑制番茄灰霉病菌菌絲細胞中的防御酶活性從而抑制菌絲生長。此外，通過測定胡椒堿對番茄灰霉病菌菌體SDH和NAD-MDH酶活性，結果顯示SDH和NAD-MDH酶活性均有不同程度的降低。SDH和NAD-MDH酶是三羧酸循環中的關鍵酶，三羧酸循環是需氧生物體內普遍存在的代謝途徑，因為細胞通過呼吸代謝獲取能量，所以三羧酸循環受阻將導致細胞死亡。番茄灰霉病菌菌體中的SDH和NAD-MDH酶活性被胡椒堿抑制，導致菌絲體活力下降，從而對菌絲生長起到了抑制作用。

在研究胡椒堿對番茄灰霉病菌抑菌機理基礎上，為提高對番茄灰霉病菌抑制效果，還有很多工作要做。如在盆栽或者大田條件下應用胡椒堿對活體番茄灰霉病菌抑制效果進行測定，以便胡椒堿更好應用于實踐生產中。此外，還應通過分子層面上探索胡椒堿對番茄灰霉病菌抑制作用，更深一步的探討其作用靶點。

從植物中篩選出活性更高的化合物，尋找更為理想的殺菌劑，是當前十分活躍的研究領域。本研究表明，胡椒堿對番茄灰霉病菌有著良好的抑制效果，可針對多靶點進行抑制，研究結果為番茄灰霉病菌的防治提供了新方向，為新型無公害防治藥劑的研制提供了基礎理論依據和參考借鑒。