預(yù)混合飼料中維生素A、D3 和E快速聯(lián)檢的高效液相色譜法

段春宇

（山東省莒南縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心 山東臨沂 276600）

脂溶性維生素是畜禽維持健康、生長、繁殖和生產(chǎn)所必需的一類有機(jī)微量營養(yǎng)物質(zhì)。脂溶性維生素對(duì)于畜禽體內(nèi)的代謝活動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)生長，增強(qiáng)動(dòng)物抗病和抗應(yīng)激能力，一般情況下，畜禽不能合成或難以合成足量的維生素滿足自身的需要，必須由日糧提供，但是飼料中的含量也是有限的，不夠滿足養(yǎng)殖業(yè)對(duì)于所飼喂畜禽快速、健康生長的需求，在飼料中添加適量維生素是保障畜禽健康的重要途徑。

脂溶性維生素對(duì)畜禽生長具有重要作用，但是需要量是微量的，過多攝入會(huì)導(dǎo)致畜禽中毒，農(nóng)業(yè)部1224 公告制定了推薦用量和最高限量，因此飼料生產(chǎn)企業(yè)與養(yǎng)殖企業(yè)要根據(jù)飼養(yǎng)的不同畜禽品種與畜禽生長階段對(duì)維生素的營養(yǎng)需要量進(jìn)行調(diào)控，這就需要準(zhǔn)確檢測(cè)飼料中脂溶性維生素的含量，尤其是預(yù)混合飼料中脂溶性維生素的含量，準(zhǔn)確檢測(cè)，精準(zhǔn)調(diào)控，既滿足畜禽營養(yǎng)，又符合國家規(guī)范要求。

國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于VA、VD、VE 的檢測(cè)是分開三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法，對(duì)于檢測(cè)任務(wù)繁重的飼料廠來說，工作量較大，檢測(cè)成本較高。本研究旨在探索一種方法，同時(shí)檢測(cè)以上三種脂溶性維生素的含量，為飼料企業(yè)快速、高效檢測(cè)提供良好方法。

2 材料和方法

2.1 試劑和材料

甲醇（色譜級(jí)）（默克公司）、維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）、VD標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr.Ehrenstorfer 公司）、VE乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品（Fluka 公司）、0.45μm 有機(jī)系微孔過濾器、100mL棕色容量瓶等。

2.2 主要儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器、高速混勻器、恒溫水浴鍋、超聲波清洗儀、超純水儀、分析天平等。

2.3 樣品前處理

稱取試樣1g，精確至0.0001g，置于100mL 棕色容量瓶中，加60mL 甲醇渦旋，轉(zhuǎn)移至水浴鍋，60℃15min，蓋子不要太緊，冷卻，超聲30min，冷卻定容，過0.45μm 有機(jī)系微孔過濾器到進(jìn)樣瓶中，待檢。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品VA 乙酸酯0.1000g，VD0.0100g，VE 乙酸酯0.2000g 分別于100mL 棕色容量瓶中，加入30mL 甲醇渦旋，再加30mL 甲醇，搖勻，放入60℃水浴15min，冷卻后超聲30min，待再次冷卻后用甲醇定容，搖勻，即得2,907.00IU/mL VA、4,000.00IU/mL VD、2.00IU/mL VE 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18℃冰箱避光保存，有效期6 個(gè)月。用甲醇逐級(jí)稀釋成VA 乙酸酯11.63、58.14、116.28、290.70、581.40IU/mL；VD16.00、80.00、160.00、400.00、800.00IU/mL；VE 乙酸 酯0.008、0.040、0.080、0.200、0.400IU/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5 色譜條件

色譜柱：Kromasil C色譜柱（規(guī)格：150×4.6mm，粒度5μm）；流動(dòng)相：甲醇；流速：1.0mL/min；紫外檢測(cè)器波長：285nm；柱溫40℃；進(jìn)樣量：20μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 測(cè)定圖譜

檢測(cè)圖譜峰形好，保留時(shí)間穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜測(cè)定圖譜見圖1、加標(biāo)樣品見圖2、待檢樣品見圖3。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜

圖2 加標(biāo)樣品圖譜

圖3 待檢樣品圖譜

3.2 線性關(guān)系、檢出限和定量限

配制好的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按2.5 色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，VA 線性關(guān)系良好，線性方程為y=15.42414x+38.18668，相關(guān)系數(shù)（r）為0.99989；VD線性關(guān)系良好，線性方程為y=0.693718x+1.04216，相關(guān)系數(shù)（r）為0.99997；VE 線性關(guān)系良好，線性方程為y=4.64979x+4.82632，相關(guān)系數(shù)（r）為0.99998。以基線噪聲3 倍的峰面積相應(yīng)的樣品檢出濃度作為檢出限，以10 倍的峰面積相應(yīng)的樣品檢出濃度作為定量限，測(cè)得3 種維生素的檢出限和定量限，即VA 檢出限為1.0×10IU/kg、定量限為3.3× 10IU/kg；VD檢出限為1.5× 10IU/kg、定量限為5× 10IU/kg；VE 檢出限為6IU/kg、定量限為20IU/kg。

3.3 精密度和回收率

取兩份不同的空白預(yù)混合飼料樣品，稱取1g，精確至0.0001g，分別添加適量的VA、VD和VE 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液溶液，制得三個(gè)添加水平的樣品，簡(jiǎn)稱加標(biāo)1 和加標(biāo)2，按照2.3 方法處理加標(biāo)樣品，每個(gè)添加重復(fù)5 次，然后分別上機(jī)測(cè)定。隨機(jī)選取維生素預(yù)混合飼料6 份：樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6，進(jìn)行平行性測(cè)定，分別做5 次平行。檢測(cè)結(jié)果見表1，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，說明檢測(cè)方法的精密度較好。測(cè)定結(jié)果顯示，加標(biāo)1回收率VA 為94.69%～97.40%、VD為95.67%～98.91%、VE 為95.32%～97.28%，加標(biāo)2 回收率VA 為96.77%～98.38%、VD為94.93%～98.04%、VE 為94.39%～96.45%%，說明方法準(zhǔn)確性較好。

表1 待檢樣品測(cè)定結(jié)果

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本文探索了一種能同時(shí)、快速檢測(cè)預(yù)混合飼料中VA、VD和VE 含量的檢測(cè)方法。與GB/T 17817—2010、GB/T 17818—2010、GB/T 17812—2008 相比，可以一次前處理、一次上機(jī)同時(shí)檢測(cè)三種脂溶性維生素的含量，節(jié)省了時(shí)間和試劑成本。該方法前處理操作簡(jiǎn)單，流動(dòng)相成分僅一種，步驟少、方便快捷；檢測(cè)結(jié)果精密度高、準(zhǔn)確度好。該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、高效，為實(shí)驗(yàn)室繁重檢驗(yàn)任務(wù)提供良好的參考。