浐灞河生態區冬夏季節微生物群落結構特征研究

劉澤岸 孫 琳

(浙江省水利水電勘測設計院有限公司,浙江 杭州 310002)

近年來,西北地區城市化不斷加快,城鎮居民集中的地區有大量含氮污水排放到水體中,城市河流的水環境污染日益嚴峻[1]。河流作為城市形成與發展過程中的資源和環境的重要載體[2],現今在飲用水工程[3]、工業用水[4]、農業灌溉[5]及景觀娛樂[6]等方面都起到重要作用。因此,城市河流環境和生態問題的日益突出將在一定程度上影響城市的發展[7-8]。而微生物對外界環境變化較為敏感,微生物的研究已經廣泛應用到水體污染治理、污染土壤修復等工程中[9-12]。微生物可以通過同化和異化作用來降解污染物[13],減少污染物的積累,有助于維持水生態系統的穩定。

當前關于城市水體微生物群落的研究仍以湖泊為主[14-16],對于河流微生物的研究相對較少[17-19]。如萬甜等[20]采用高通量測序技術對渭河流域微生物群落多樣性進行了分析;袁博等[21]研究了灞河流域溶解性有機質(DOM)的熒光光譜特征及其對細菌組成的影響;王佳等[22]通過聚合酶鏈式反應(PCR)—變形梯度凝膠電泳(DGGE)技術對豐水期、平水期和枯水期的渾河底泥微生物進行了指紋圖譜分析。對于城市河流水體中微生物的研究則更少。張崇淼等[23]通過細菌培養技術、PCR檢測和DGGE分析技術,對城市河流浐灞河中的異氧菌耐藥率、四環素抗性基因進行了研究。本研究基于Illumina MiSeq高通量測序技術獲取浐灞河生態區水體中微生物信息,分析城市河流的微生物群落結構的空間分布規律和多樣性;通過冗余分析 (RDA)探究微生物群落與環境因子之間的相關關系。這對流域水生態系統健康發展具有重要意義,為西安城市河流的污染治理、微生物生態修復及水環境健康發展提供理論支撐和依據。

1 方 法

1.1 研究區域概況

浐灞河生態區位于浐灞河的城市段,地處西安市城區東部,南起浐河繞城高速,北至灞河入渭口,區域地勢為南高北低,由人為修筑橡膠壩、人工護坡等方式,形成城市淺水河流。浐河與灞河作為主要水體,連接秦嶺和渭河,是西安市生態敏感的地帶,其水生態的變化產生的影響輻射巨大[24]。研究區域內分布兩處污水處理廠,其中西安市第三污水處理廠位于浐河桃花潭處,西安市第五污水處理廠位于灞河下游,其出水口均在河道沿岸,出水匯入河流;區域內共分布22座橡膠壩,其中灞河段10座,浐河段12座,通過橡膠壩嚴格控制浐灞河水位和流量,在營造城市水景觀、維護城市水安全等方面起到重要作用。

1.2 采樣點布設與樣品采集

基于水質監測和河流采樣點的布設原則,結合浐灞河生態區的水環境現狀,對流域采樣點布置如圖1所示,以進行水體樣本的水質和微生物分析。分別于2019年2月和7月進行冬、夏兩季采樣,采樣點自下游到上游依次是入渭口、第五污水處理廠出水口、浐灞交匯口、世博園、第三污水處理廠出水口、長樂東路。其中,夏季時的長樂東路點因施工原因未采集到。對冬季各采樣點依次記為A1、A2、…、A6;對夏季各采樣點記為B1、B2、…、B5。

圖1 采樣點示意圖

依據采水原則,在水淺處采水,以不泛起河流底層沉積物為準;在水深處應在水面下50 cm處采水。在采集前先用采樣點水體潤洗采水容器,在水面下30 cm處取1 000 mL水樣,用無菌聚乙烯瓶臨時保存在4 ℃以下的保溫箱中,直至運送到實驗室。

1.3 測定項目

1.3.1 水質指標測定

1.3.2 脫氧核糖核酸(DNA)的提取和高通量測序

取500 mL水樣,使用0.45 μm微孔濾膜對水樣抽濾,把獲得的水體微生物樣品儲存在-20 ℃環境下。測序具體流程如下:采用DNA提取試劑盒(FastDNA?Spin Kit for Soil)提取DNA時,操作步驟按照試劑盒說明書進行。使用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質量,并采用NanoDrop ND-2000超微量分光光度計對DNA進行定量分析。PCR擴增及其高通量測序采用特異引物為5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’,對16S rRNA基因的V4～V5區進行擴增[25]。PCR擴增采用TransGen AP221CCGTC02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase,即全部樣本按照正式實驗條件進行。將PCR擴增產物混合后經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,使用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒進行回收。在PCR擴增產物熒光定量后采用Illumina MiSeq PE250/PE300進行高通量測序。用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫:對獲得的擴增產物進行序列末端修復,采用BECKMAN AMPure XP Beads,通過磁珠篩選,去除接頭自連片段,純化添加接頭后的文庫體系,使用2%瓊脂糖凝膠電泳對文庫做最終的片段選擇與純化。測序委托上海派森諾基因有限公司進行,對原始序列進行預處理,選取高質量的操作分類單元(OTU)序列進行分析。

1.4 數據分析和處理

采用Illumina MiSeq平臺對群落DNA片段進行Paired-end (雙端)測序,原始雙端測序數據經滑動窗口法進行質量篩查,質量合格后使用Flash軟件對樣品進行reads配對連接。運用Qiime軟件識別疑問序列,調用Usearch v5.2.236檢查并剔除嵌合體序列。

對優質序列通過QIIME (http://qiime.org/ tutorials/index.html)進行OTU劃分,獲得每個OTU所對應的分類學信息。通過繪制稀釋曲線和計算用于Alpha多樣性統計。利用Canoco5.0軟件對微生物群落和環境因子開展主成分分析(PCA),分析樣本間的相似性與差異性,Origin9.1繪制豐度柱狀圖。

2 結果與討論

2.1 水質狀況分析

表1為浐灞河生態區各采樣點在冬、夏兩季的理化指標特征。冬季各采樣點WT在8.2～14.3 ℃,其中A2和A5采樣點作為污水處理廠出水口WT較高。根據《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002),各采樣點TN均低于Ⅴ類水標準。冬季各采樣點TP在0.131～0.558 mg/L,均值為0.297 mg/L,總體表現為Ⅳ類水標準,其中A4和A6采樣點的TP表現為Ⅲ類水標準,A1采樣點TP最高,為0.558 mg/L。夏季各采樣點TP為0.080～0.408 mg/L,均值為0.220 mg/L,總體表現為Ⅳ類水標準,在B3和B4采樣點的濃度較低,為Ⅱ類水標準,在B2采樣點最高,為0.408 mg/L。

冬、夏季浐灞河生態區水體理化指標具有明顯的空間差異性。污水處理廠出水口附近各物理化學指標均有異于其余采樣點,具體表現為WT大多略高于受納水體,pH大多略低于其他采樣點,DO含量略低于其他采樣點。此外,灞河上游水質優于下游,在浐河匯入后,灞河下游水質變差;污水處理廠出水口的TN、TP、COD各污染指標大多升高,是造成浐灞河生態區水體理化指標空間差異性的主要因素。

由表1可以看出,采樣點水質指標劣于Ⅴ類水標準,主要是TN嚴重超標。可見氮污染是導致浐灞河水質較差的主要原因。國內許多研究人員對浐灞河生態區水質狀況進行了調研和分析,孫佳樂[26]通過分析得出,兩個污水處理廠出水口處WT、營養鹽濃度比浐灞河生態區段其他采樣點濃度高,且TN低于Ⅴ類水要求;陳紅[27]對灞河城市段水質調研結果表明,TN在全年各采樣點均處于劣Ⅴ類水,為污染程度最高的指標。通過分析國內研究人員對浐灞河水環境狀況的調研成果,結合西安市實際情況,得出水質污染的主要原因有以下幾個方面:作為城市河流,部分未達標的工業和未處理的生活污水直接排入河道;地表徑流補償減少,河流自凈能力下降;上游工業生產混亂,砍伐無序,破壞地表徑流規律,間接污染水質[28]。

表1 各采樣點理化指標

可以通過采取以下防治措施改善河流水質:做好河流保護工作,上游河道兩側做好林木防護,河流城市段建設護欄;嚴控污染排放問題,對于上下游工業和生活污水排放、污水處理廠排水,建立責任明確的規章并嚴格執行。此外,除了傳統水質防治措施外,微生物修復技術也應得到廣泛應用。

2.2 微生物群落多樣性分析

微生物群落的多樣性,目前常用Alpha多樣性來描述,可以直觀反映不同環境微生物群落豐富度、多樣性和均勻度,包括豐富度指數(Chao1指數、ACE指數,反映豐富度)和多樣性指數(Shannon-Wiener指數、Simpson指數,反映多樣性和均勻度)。微生物Alpha多樣性統計結果見表2。

由表2可得,冬季各采樣點的Chao1指數和ACE指數最高的是采樣點A5,最低的是A1。兩個豐富度指數表現出的采樣點變化趨勢一致,均表現為A5>A2>A3>A6>A4>A1。Shannon-Wiener指數和Simpson指數最高的是采樣點A5,最低的是采樣點A2。各采樣點Shannon-Wiener指數大小順序依次為A5>A6>A4>A3>A1>A2,Simpson指數大小順序依次為A5>A6>A4>A1>A3>A2。

分析結果可知,A5采樣點作為第三污水處理廠出水口,采樣點豐富度、多樣性與均勻度在所有采樣點中最高;而A2采樣點豐富度指數較高,多樣性指數卻最低,表明物種較多,均勻度卻較差,可能的原因是污水處理廠出水導致出水口附近水體富營養化嚴重,各類營養鹽含量較高,為微生物提供了營養物質。

由表2可得,夏季各采樣點的Chao1指數和ACE指數最高的是采樣點B2,最低的是采樣點B4。兩個豐富度指數趨勢一致,大小順序依次為B2>B5>B3>B1>B4。Shannon-Wiener指數和Simpson指數最低的均是采樣點B4。Shannon-Wiener指數最高的是采樣點B2,Simpson指數最高的是采樣點B3與B2。Shannon-Wiener指數大小順序依次為B2>B5>B3>B1>B4,Simpson指數大小順序依次為B3=B2>B5>B1>B4。

表2 Alpha多樣性統計結果

分析結果可知,夏季各采樣點微生物群落指數大小趨勢大體一致,均顯示在B2采樣點,即第五污水處理廠出水口最大,意味著該點微生物群落豐富度、多樣性與均勻度在所有采樣點中最高,第三污水處理廠出水口采樣點次之,B4采樣點最小。

總體來看,夏季各采樣點微生物群落多樣性高于冬季,在同一季節微生物群落多樣性存在空間差異,污水處理廠出水口微生物群落多樣性相對更高，表明浐灞河生態區水體的微生物群落特征有顯著的時空差異。

2.3 微生物群落分布規律

冬、夏季各采樣點菌群在門水平上總體相似,但又存在差異。在冬季,變形菌門(Proteobacteria)在所有采樣點中相對豐度最高,為47.0%,是研究水域的代表菌門;其次是擬桿菌門(Bacteroidetes),其相對豐度為30.3%,在每個采樣點中僅次于變形菌門;藍藻門(Cyanobacteria)在A1、A3采樣點相對豐度較高;放線菌門(Actinobacteria)在各采樣點中都有分布,在A3、A4采樣點相對豐度較高;剩余菌門只分布于個別采樣點。放線菌門、藍藻門相對豐度分別為12.1%、5.2%。各采樣點中,A5采樣點物種門類最多即多樣性最好,A2采樣點門類最少,物種均勻度低。

在夏季,變形菌門在所有采樣點相對豐度最高,為50.7%;其次是放線菌門,相對豐度為20.9%,除在B1采樣點相對豐度略低,在其余采樣點中相對豐度僅次于變形菌門;藍藻門相對豐度在B1采樣點相對豐度僅次于變形菌門,在所有采樣點中最高,相對豐度呈下游大于上游趨勢;厚壁菌門(Firmicutes)主要分布在B4、B5采樣點,其他采樣點相對豐度很低或無;擬桿菌門在各采樣點分布相似但相對豐度較小;其他菌門在不同采樣點相對豐度分布差異較大。除了變形菌門外,放線菌門、藍藻門、厚壁菌門的相對豐度分別為20.9%、14.3%、6.0%。

由圖2可總結出，冬、夏兩季門水平菌群以變形菌門、藍藻門、擬桿菌門和放線菌門等優勢細菌為主。已有眾多學者發現它們廣泛分布于淡水水域中[29-30]，存在顯著的季節性差異,菌群組成與相對豐度都有明顯變化。在冬季與夏季的菌群組成中,變形菌門相對豐度均最大,且大多夏季大于冬季。變形菌門包含的部分菌屬有利于水質凈化(如氧化氨的亞硝化單胞菌屬)。此外,變形菌門也包括很多病原菌(如霍亂弧菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等),在具有凈化水質功能的同時也存在致病風險;放線菌門夏季的相對豐度大于冬季,季節之間相對豐度變化幅度明顯,它是一類革蘭氏陽性細菌,在污水的處理等方面也有廣泛的用途;藍藻門在冬季與夏季均出現在菌群中,相對豐度夏季大于冬季;擬桿菌門相對豐度冬季大于夏季,其在冬季是主要菌群，相對豐度在各采樣點均很大,夏季相對豐度大大降低,很多擬桿菌綱的菌種生活在人或者動物的腸道中,有些時候成為病原菌[31-34]。

圖2 冬、夏季各采樣點門水平微生物群落結構分布

2.4 微生物群落相似性分析

通過R軟件,對屬水平的微生物群落結構進行PCA分析。冬、夏季微生物群落PCA分析結果見圖3。

圖3 冬、夏季菌群PCA分析

由圖3 (a)可知,PCA第一主成分(PC1)對各樣本物種差異解釋率為57.76%,第二主成分(PC2)對各物種差異解釋率迅速下降為27.33%,共占85.09%,說明能夠充分表達微生物群落實際的差異性和相似性。此外,A2游離于各采樣點之外,可能是第五污水處理廠的出水影響該點微生物群落結構,導致該點并不與相鄰采樣點聚集。

由圖3 (b)可知,PC1對各樣本物種差異解釋率為62.16%,PC2對各物種差異解釋率迅速下降為17.84%,共占80.00%,說明能夠充分表達微生物群落實際的差異與相似性。B4獨自游離于其他采樣點之外,表明在夏季,浐灞河生態區段上游與下游菌群結構差異明顯。

2.5 微生物群落與環境因子相關性分析

本研究基于Canoco5.0軟件,選取相對豐度較高的細菌門分類水平進行微生物群落與環境因子之間的相關性分析,7個環境因子共解釋了80.10%的物種變化信息，如圖4所示。從環境因子的向量長度可以看出:大部分環境因子對物種的分布影響較大,其中WT最大，為35.20%,pH、DO次之，分別為15.80%、9.30%。將物種向量與環境因子向量結合分析:藍藻門與WT、pH、DO呈正相關,與TP、TN、氨氮、COD呈負相關;浮霉菌門與WT、COD呈正相關,與TP、TN、氨氮、pH、DO呈負相關;變形菌門、放線菌門、厚壁菌門與WT、COD呈正相關,與TP、TN、氨氮、pH、DO呈負相關;綠彎菌門與WT、COD、TP、TN、氨氮呈正相關,與pH、DO呈負相關;擬桿菌門、疣微菌門與TP、TN、氨氮、pH、DO呈正相關,與WT、COD呈負相關。7個環境因子只有WT(P=0.004)、pH(P=0.019)和DO(P=0.042)達到了顯著性水平,而其他環境因子未達到顯著性水平,表明水體的WT、pH以及DO是影響冬、夏兩季生態區段水體微生物群落結構變化的關鍵環境因子,它們的影響比TN、TP等化學指標更顯著。

圖4 物種—環境因子RDA

3 結 論

(1) 浐灞河生態區水質污染因子主要為TN,灞河上游水質優于下游,在浐河匯入后,灞河下游水質變得更差,污水處理廠出水口處水質最差。

(2) 利用Illumina MiSeq高通量測序技術,對浐灞河生態區6個采樣點冬、夏季節水樣進行測序,得出冬季兩個豐富度指數均表現為A5>A2>A3>A6>A4>A1,兩個多樣性指數均為A5最高、A2最低;夏季各采樣點微生物群落指數大小趨勢大體一致。夏季各采樣點微生物群落多樣性總體高于冬季,在同一季節微生物群落多樣性存在空間差異,污水處理廠出水口微生物群落多樣性相對更高。浐灞河生態區水體的微生物群落呈現顯著的時空差異特征。

(3) 在夏季,變形菌門的相對豐度最高,為50.7%,其次為放線菌門,相對豐度為20.9%;在冬季,變形菌門的相對豐度最高,為47.0%,其次為擬桿菌門,相對豐度為30.3%。

(4) 微生物群落與環境因子之間的相關性分析結果顯示,7個環境因子只有WT(P=0.004)、pH(P=0.019)和DO(P=0.042)達到了顯著性水平,表明WT、pH以及DO是影響冬、夏兩季生態區段水體微生物群落結構變化的關鍵環境因子,這些相關性關系解釋了浐灞河水質分布規律。