不同葉果比對‘玫瑰香’葡萄果實可揮發香氣合成的影響

李洋，田淑芬*，王超霞，蘇宏，李凱，黃麗秋

（1. 天津農學院園藝園林學院，天津 300380；2. 天津農業科學院果樹研究所，天津 300380）

‘玫瑰香’是我國的主栽葡萄品種之一。該品種香氣濃郁、口味獨特，既可以鮮食、制汁，也是制作葡萄酒的良好原料[1]，用漢沽產的‘玫瑰香’葡萄釀制的白葡萄酒多次獲得國際金獎[2]。葡萄果實品質的衡量指標有很多，其中香氣是非常重要的指標之一。葡萄香氣是一個相對復雜的性狀，由多種揮發性化合物構成[3]，主要包括醛類、醇類、酯類、酮類和萜烯類等[4-5]。

葡萄果實揮發性香氣化合物的合成途徑主要有三種：萜類代謝、脂肪酸代謝和氨基酸代謝途徑[6-7]。里哪醇合成酶基因（Linalool synthetase,LIS）、異戊烯基焦磷酸還原酶基因（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,HDR）、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（Carotenoid cleavage dioxygenase,CCD）、9-順式環氧類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（9-cis epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）都是萜類代謝合成途徑中的基因，LIS是萜類物質合成后期的關鍵基因，催化里哪醇的合成。HDR是2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）上游途徑的限速酶，與植物類胡蘿卜素代謝關系密切且正相關。CCD和NCED可將類胡蘿卜素分解生成下游產物，形成降異戊二烯類物質或脫落酸（ABA），其中CCD1的表達調控與β-紫羅酮的合成有關。脂肪酸代謝途徑包括脂氧合酶途徑和β-氧化途徑，脂氧合酶基因（lipoxygenase,LOX）、脂氫過氧化物裂解酶基因（hydroperoxide lyase,HPL）和乙醇脫氫酶基因（alcohol dehydrogenase class,ADH）都是脂氧合酶途徑中的相關基因。LOX使不飽和脂肪酸生成氫過氧化物，再經過氫過氧化物裂解酶HPL生成醛類物質（己醛或己烯醛），后在醇脫氫酶的作用下生成醇。VvLOXA與己烯醛的形成有關，主要在果皮中表達，尤其在轉色期大量表達，而VvADH3與反-2-己烯醛有明顯的正相關性[8-10]。

成熟葡萄中的香氣成分受多種因素的影響，包括品種、生長環境條件、栽培管理和收獲時間[11-14]。在許多情況下，這些變量會通過改變相關香氣生物合成途徑中基因的表達量，而改變代謝產物的量與組成[15]。在栽培管理中，修剪方式對調節葡萄生長起著很重要的作用，通過以源庫單位的可變性為理論基礎，調節光合產物在不同器官之間的分配與運輸，使得樹體的生殖生長和營養生長達到平衡[15-17]。通過修剪改變葉果比，在一定程度上可以影響果實的品質與香氣[18]。有研究表明，提高葉果比可顯著降低果實中蘋果酸、酒石酸質量比，顯著提高可溶性糖、花色苷、總酚含量以達到提高葡萄果實口感和香氣品質的目的[19-21]。因此，研究不同葉果比對葡萄果實香氣的影響具有重要經濟價值。

本試驗選取‘玫瑰香’葡萄為試材，通過修剪成不同葉果比的方式，研究其對果實成熟前后可揮發性香氣成分的變化及與香氣形成相關基因的表達，探索‘玫瑰香’葡萄適宜的栽培管理技術，為農業栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年4月16日至8月14日在天津農科院武清現代農業科技創新基地進行。供試品種為7年生‘玫瑰香’葡萄，日光溫室種植，株行距為1.0 m×2.0 m，獨龍干雙臂“V”形葉幕，結果新梢間距為15 cm，每個新梢留1果穗。

1.2 試驗設計

試驗設置2個不同的葉果比處理，分別是8∶1（A處理）和16∶1（B處理），每個處理15株樹。A處理修剪方式：4葉（果穗以下4葉，副梢全部抹除）＋2葉（果穗以上2葉，副梢全部抹除）＋2葉（摘心后保留2葉，副梢全部抹除）；B處理修剪方式：4葉（果穗以下4葉，副梢全部抹除）＋8葉（果穗以上4葉，每節保留副梢1葉）＋4葉（摘心后保留2葉，每節保留副梢1葉）。在坐果后進行定期修剪，以保持試驗過程中葉果比不變，其他管理同常規。

取樣時期：分別在5月30號（轉色期）、6月26號（始熟期）和7月22號（成熟期）采集果穗上、中、下三個部位果實樣品，保存在-80 ℃冰箱，用于可揮發香氣成分和基因相對表達量的檢測。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 果實香氣成分的測定

所有樣品于2019年11月8日解凍后勻漿，采用美國安捷倫7890B-5977A氣相色譜-質譜儀（GC-MS）進行香氣分析。

色譜條件：載氣（高純He）：純度≥99. 99%，流速1.0 mL·min-1，分流比5∶1；升溫程序：35 ℃保持2 min，以4 ℃·min-1升至200 ℃，然后以30 ℃·min-1升至250℃，保持5 min；進樣口溫度：250 ℃。

質譜檢測條件：離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；電子轟擊源：70 eV；掃描范圍：30～300 amu。

利用頂空固相微萃取-氣質聯用（HS-SPME-GCMS）分析方法。對檢測的揮發性成分通過未知物分析軟件與NIST 11.L譜庫（均為美國Agilent公司）提供的標準譜圖進行匹配，如果匹配因子大于80（最高100），通過相同GC-MS條件下標準品的保留時間和質譜圖進一步比對確認。

定量分析：稱取2.4 g NaCl于20 mL頂空瓶中，加入勻漿樣品8 mL，并加入內標物2-辛醇8 μL（180 mg·L-1，無水乙醇稀釋），頂空瓶加蓋密封后待測。CTC固相微萃取條件：45 ℃預熱5 min，磁力攪拌子轉速為250 r·min-1（攪拌間歇式運行，轉5 s，停2 s)，45 ℃萃取50 min，然后GC進樣，250 ℃解吸2 min，采集數據。目標化合物采用內標-標準曲線法定量，標準曲線由5點繪制，由化學工作站計算定量結果。

1.3.2 相關基因的測定

所有樣品在液氮環境中進行研磨成粉末狀，使用RNA試劑盒提取葡萄果實的總RNA，以總RNA為模板利用TakaraPrimeScript TMRT-PCR試劑盒反轉錄合成cDNA。以EF-1α為內參基因進行熒光定量PCR，選取香氣合成過程中的關鍵酶基因，引物參照Martin等[22]的方法。熒光定量擴增體系10 μL：2×SuperReal PreMix Plus 5 μL、上下游引物混合物（10 mmol）0.3 μL、cDNA模板0.4 μL和RNase-free水4.3 μL。

反應條件：95 ℃ 15 min；然后95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個循環；最后進行溶解曲線測定。熒光定量結果通過相對定量法（2-△△t）進行分析，每次試驗重復3次。

檢測的基因包括：異戊烯基焦磷酸還原酶基因（4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase,HDR）、里哪醇合成酶基因（Linalool synthetase,LIS）、類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（Carotenoid cleavage dioxygenase 1,CCD1）、9-順式環氧類胡蘿卜素裂解雙加氧酶基因（9-cis epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）、脂氧合酶基因（lipoxygenase,LOXA）、脂氫過氧化物裂解酶基因（hydroperoxide lyase 1,HPL1）和乙醇脫氫酶基因（alcohol dehydrogenase class III,ADH3）。

1.4 數據分析

采用IBM SPSS 25和Excel進行數據分析及圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同時期的香氣成分與含量差異

果實樣品中均檢測出41種香氣物質，按照化合物結構分別為萜烯類6種、醇類9種、醛類8種、酯類11種、酮類4種和烯類3種。由表1可知，‘玫瑰香’葡萄果實香氣中醛類、醇類、萜烯類物質含量較高，而烯類物質的含量最少。在整個果實發育期，始熟期A處理中果實香氣物質含量最高，為3907.72 μg·L-1，同時期醛類、醇類和烯類物質含量也達到較高水平，而此時期B處理的果實香氣物質含量比A處理低563.09 μg·L-1。B處理在轉色期和成熟期的果實香氣物質含量分別比A處理高342.24 μg·L-1和432.62 μg·L-1。萜烯類物質作為‘玫瑰香’葡萄特征香氣的主要成分，在始熟期B處理下含量最高，為870.21 μg·L-1。除此之外，3個處理時期中B處理的萜烯類物質含量均比A處理高，尤其是始熟期和成熟期B處理下萜烯類物質的含量比A處理分別高239.39 μg·L-1和126.27 μg·L-1。而醇類、酮類、醛類、烯類物質在始熟期B處理下都比A處理的含量低。總的來說，隨著‘玫瑰香’果實的逐漸成熟，香氣物質的含量先增加后減少，各個成分也隨之發生變化。

表1 玫瑰香果實香氣物質含量Table 1 Contents of aroma substances in Muscat Hamburg grapeμg·L-1

從圖1中看出，對于同一處理，從轉色期到成熟期，醛類占比變化不大，維持在50%，醇類物質占比從30%下降到20%左右，萜烯類物質占比從10%升高到30%左右。以A處理為對照，在轉色期和成熟期，B處理對‘玫瑰香’葡萄香氣物質占比影響不大。在始熟期，B處理中的果實醇類物質占比低于A處理，而萜烯類物質占比高于A處理。以上結果表明，在轉色期和成熟期，葉果比對‘玫瑰香’葡萄果實香氣物質占比影響不大；而在始熟期，高葉果比能減少果實香氣中醇類物質的占比，增加萜烯類物質的占比。

2.1.1 醛類香氣成分的分析

由圖1可知，醛類物質是所有香氣成分中占比最高的，為43.91%～62.21%。從圖2可以看出，醛類物質在始熟期含量最高，隨著果實成熟逐漸降低。其中反式-2-己烯醛含量最高（77.63%～84.06%），其次是正己醛（13.18%～19.57%）。在轉色期和成熟期，B處理果實中反式-2-己烯醛含量高于A處理，分別增加了212.46 μg·L-1和108.60 μg·L-1；在始熟期，B處理果實中反式-2-己烯醛含量比A處理低151.27 μg·L-1；而在整個生長過程中，A處理和B處理果實中正己醛含量變化不大（圖2）。結果表明，高葉果比能增加果實中反式-2-己烯醛含量，對果實中正己醛含量的影響不大。總之，在果實發育過程中，高葉果比增加了‘玫瑰香’葡萄果實香氣中醛類含量。

2.1.2 醇類香氣成分的分析

醇類香氣物質是所有香氣類型中總量占比第二的香氣物質，醇類物質的含量和占比最高的為始熟期A處理（分別為1376.50 μg·L-1和35.23%），最低的為成熟期A處理（分別為497.89 μg·L-1和19.22%）。醇類香氣物質主要是1-己醇、反式-2-己烯-1-醇和2-乙基己醇（圖3）。在始熟期，以A處理為對照，B處理使果實中1-己醇的含量增加了74.60 μg·L-1、反式-2-己烯-1-醇含量增加了28.26 μg·L-1，2-乙基己醇含量減少了788.41 μg·L-1；而在成熟期，B處理使果實中2-乙基己醇含量增加了87.37 μg·L-1。總而言之，高葉果比在轉色期和成熟期能增加‘玫瑰香’葡萄果實特征香氣醇類物質的含量，而在始熟期醇類物質含量低于低葉果比處理。

2.1.3 萜烯類香氣物質的分析

‘玫瑰香’果實中的萜烯類物質主要是香葉醇、里哪醇、β-蒎烯和香茅醇，其含量隨著果實成熟逐漸增加（圖4）。在始熟期，B處理果實中的香葉醇和β-蒎烯含量比A處理分別高90.82、37.95 μg·L-1；在成熟期，B處理果實中的香葉醇和里哪醇含量比A處理分別高48.02、68.42 μg·L-1。以上結果說明，在轉色期后，高葉果比能增加‘玫瑰香’葡萄果實特征香氣萜烯類物質含量。

2.1.4 酮類香氣物質的分析

‘玫瑰香’果實中酮類物質主要是6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-辛酮和2-壬酮（圖5），隨著果實的成熟，酮類物質逐漸減少，高葉果比可增加果實中6-甲基-5-庚烯-2-酮含量，而其他酮類物質變化不大。綜上所述，在成熟期之前，高葉果比可增加果實香氣中酮類物質的含量。

2.2 不同葉果比對‘玫瑰香’果實香氣相關基因表達的影響

2.2.1 不同葉果比下果實萜烯類香氣相關基因的表達

圖6所示，以處理A為對照，在轉色期處理B在HDR和CCD1基因的表達上調，LIS和NCED基因表達下調；在始熟期，HDR和NCED基因表達與對照沒有明顯變化，LIS和CCD1基因的表達上調；在成熟期，HDR和CCD1基因表達均上調，LIS基因表達下調，NCED基因表達與對照沒有明顯變化。以上結果說明，16∶1的葉果比與8∶1的葉果比處理在影響‘玫瑰香’果實萜烯類香氣部分相關基因表達相比較，高葉果比在轉色期促進HDR和CCD1基因的表達，抑制LIS和NCED基因的表達；在始熟期，促進LIS和CCD1基因的表達；在成熟期，促進HDR和CCD1基因的表達，抑制LIS基因的表達。由此可見，高葉果比可在一定程度上促進‘玫瑰香’果實成熟期萜烯類香氣部分相關基因表達，使萜烯類化合物含量增加。

2.2.2 不同葉果比下果實醇酯類香氣相關基因的表達

圖7表現了不同葉果比處理對‘玫瑰香’果實醇酯類香氣相關基因表達的影響。以處理A為對照，處理B在轉色期對LOXA、HPL1和ADH3基因表達與對照沒有明顯變化；在始熟期，LOXA基因的表達下調，HPL1和ADH3基因表達與對照沒有明顯變化；在成熟期，LOXA、HPL1和ADH3基因表達均上調。以上結果說明，在影響‘玫瑰香’果實醇酯類香氣部分相關基因表達方面，16∶1的葉果比在轉色期對LOA、HPL1和ADH3基因的表達影響不大，在成熟期促進了LOXA、HPL1和ADH3基因的表達。由此可見，高葉果比在一定程度上促進‘玫瑰香’果實成熟期醇酯類香氣相關基因表達，使得醇類和醛類物質含量增多，但在轉色期和始熟期對醇酯類香氣相關基因表達的影響不大。

3 討論與結論

不同的葉果比會影響葡萄果實品質和產量。夏季修剪通過改變葉果比調節植物庫源關系及改善樹冠內微環境，使光合作用的利用率最大化，從而影響果實品質。香氣是葡萄果實風味、品種特性的重要組成部分，也是衡量果實品質重要的指標之一[23-27]。試驗結果表明，高葉果比可提高‘玫瑰香’葡萄果實香氣物質含量。其主要原因可能是高葉果比葉面積大，使光合產物的合成量增多，果實中糖分含量增加，從而進一步促進果實成熟過程中次生代謝產物的積累，如葡萄香氣物質的合成積累[28-31]。

里哪醇、香葉醇被認為是‘玫瑰香’葡萄果實中單萜類物質，是香氣中的主要呈香成分[26]。在始熟期和成熟期，高葉果比分別增加了香葉醇和里哪醇物質的含量，使果實的香味更加濃郁，而萜烯類相關的基因也在始熟期及成熟期表達上調。研究表明，在單萜類生物合成過程中，單萜醇前體的累計能夠使HDR基因表達上調。Reynolds等通過對‘霞多麗’葡萄疏穗處理的研究發現，在果實發育早期進行疏穗處理可以增加果實中游離態萜烯物質含量，這與該試驗結果一致[32-33]。值得注意的是，在始熟期高葉果比反而使果實中醛類、醇類物質的含量下降；除此之外，轉色期含有少量大馬酮，始熟期和成熟期未檢測到此物質，可能是由于大馬酮所在的降異戊二烯合成途徑與脫落酸合成途徑共用同一種底物，隨著果實的成熟，脫落酸合成增加，大馬酮合成相應減少。

綜上所述，對于‘玫瑰香’品種來說，高葉果比在轉色期增加酮類、醇類和醛類物質含量，而在始熟期減少醛類、醇類物質含量。高葉果比可在成熟期促進葡萄果實香氣中萜烯類物質和醇酯類物質相關基因的表達，使得成熟期果實中萜烯類物質和醇酯類物質含量增加。因此，在實際生產中，較高葉果比可以通過提高光合作用效率增加‘玫瑰香’葡萄果實香氣化合物的合成。