外源植物激素對‘赤霞珠’葡萄冬芽萌發(fā)的影響

張鴻雁，陳莉，屈嘉燕，李少華，曾青青，張鵬，管雪強，張克坤，房玉林*，陳可欽*

（1. 西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100/西北農(nóng)林科技大學合陽葡萄試驗示范站，陜西合陽 715300/西北農(nóng)林科技大學寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站，寧夏永寧 750104；2. 山東省葡萄研究院，濟南 250100/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心，山東煙臺 265608）

與其他多年生植物類似，葡萄進化出了冬季休眠策略，以抵御寒冷威脅。冬芽休眠不僅是葡萄生存的有效生物學特性，也是影響葡萄生產(chǎn)經(jīng)濟性的生物學事件。休眠和萌發(fā)是兩個連續(xù)的生物過程，芽休眠是溫帶落葉果樹的一種適應機制[1]，在休眠期間，植物生長受到抑制，細胞分裂受阻，呼吸和代謝活動減緩，使植物適應季節(jié)性環(huán)境變化，并能夠在惡劣的冬季環(huán)境中生存，只有在環(huán)境適合時芽才能進入萌發(fā)狀態(tài)。在休眠階段，芽的萌發(fā)受到外部或內(nèi)部信號的抑制，根據(jù)抑制信號的不同，可將每年的休眠周期劃分為3個階段：類休眠（Paradormancy，PD）、內(nèi)休眠（Endodormancy，ED）和生態(tài)休眠（Ecodormancy，ECD）[2]。類休眠是由分生組織外的因子引起的植物生長暫停，本質(zhì)上是一個器官對另一個器官的影響，例如芽的頂端優(yōu)勢。內(nèi)休眠發(fā)生在寒冷月份，此時芽的發(fā)育受到分生組織或附近組織中生理因素的調(diào)控，如低溫或光周期變化[3]，觸發(fā)了芽向內(nèi)休眠的轉變，在此階段，溫度或營養(yǎng)供應（碳水化合物、營養(yǎng)素等）的增加無法刺激芽重新生長。生態(tài)休眠標志著休眠的最后階段，此時芽已經(jīng)恢復了生長能力，但受到不利氣候條件的影響沒有萌發(fā)，通常發(fā)生在內(nèi)休眠完成后（已滿足低溫要求）。

植物激素信號轉導是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的重要信號通路[4]，控制著植物生長發(fā)育的大多數(shù)路徑。植物激素在整個生命周期中調(diào)節(jié)發(fā)育和生長，并觸發(fā)由環(huán)境變化和生物或非生物脅迫等外部刺激誘導的適應性反應。植物激素自發(fā)現(xiàn)以來一直是人們研究的熱點，影響著植物生長發(fā)育的方方面面。近年來，大量植物激素的合成、信號途徑等突變體被分離、鑒定，相應基因被克隆和研究，使人們對于植物激素在調(diào)控植物芽的生長發(fā)育方面也有了比較深入的了解。大量研究表明，許多植物激素參與了芽休眠的高度復雜的協(xié)調(diào)過程[5-9]，尤其是生長素、脫落酸和赤霉素。生長素被認為在類休眠中起重要作用，調(diào)控葡萄芽從類休眠向生長期轉變[10]；隨著時間的推移，在單芽扦插中，生長素生物合成基因的表達增加，強烈表明生長素促進葡萄芽萌發(fā)[11]。長期以來，外源赤霉素一直被用于打破休眠和促進芽萌發(fā)，但其在解除休眠中的作用因物種而異[12]。在葡萄芽自然休眠過程中，赤霉素生物合成基因的表達水平通常在休眠解除期間增加[13]；脫落酸被認為是進入休眠的關鍵內(nèi)部因素，并參與休眠誘導和維持[7]，并且在內(nèi)休眠階段是芽生長的主要抑制因子[10]；脫落酸水平的增加是植物芽和種子休眠的開始[14-15]。目前，不同激素對葡萄冬芽萌發(fā)的影響已有研究，但不同激素間作用效果的差異以及各類激素的作用機制還有待進一步挖掘。

本研究以一年生的‘赤霞珠’枝條為試材，研究不同外源激素處理下葡萄冬芽的萌發(fā)和發(fā)育狀況，并檢測不同處理下冬芽過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（OFR）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、以及植物淀粉、果糖（FT）、可溶性糖和總蛋白質(zhì)含量，闡明冬芽萌發(fā)過程與生理生化特性的相關性，為葡萄冬芽萌發(fā)調(diào)控措施的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料‘赤霞珠’于2018年定植在陜西省楊凌農(nóng)業(yè)示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學曹辛莊葡萄示范基地。株行距1.5 m×3 m，南北行向，常規(guī)管理。

1.2 激素處理

于2022年2月26日，采集長勢一致、無病害的一年生枝條，選擇健壯、飽滿的冬芽，上切口平剪、下切口斜削，制備單芽插條。

基于實驗室前期研究的葡萄冬芽相關激素檢測結果（數(shù)據(jù)未發(fā)表），選擇使用200 mg·L-1脫落酸（ABA）、25 mg·L-1的吲哚-3-甲酸（ICA）、20 mg·L-1赤霉素（GA7）、20 mg·L-1氟啶酮、100 mg·L-12,3,5- 三碘苯甲酸（TIBA）和1000 mg·L-1多效唑于2022年2月26日采集當天對冬芽進行涂抹（0 d），共計6種處理，以清水涂抹作對照。將枝條插在沙子中，定期澆水使水位保持稍沒過沙子。于25 ℃長日照（16 h/8 h）光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察萌芽率，每6 d觀察冬芽發(fā)育情況。采集激素處理后0、6、12、18 d的冬芽，沿冬芽四周將枝干和多余組織剪除，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 萌芽率調(diào)查及冬芽萌發(fā)過程觀察

以冬芽鱗片開裂，露出清晰可見的綠色組織視為芽萌發(fā)，萌芽率以百分比計算。

每組隨機選擇3～4個激素處理后0、6、12 d的單芽插條（因18 d芽已萌發(fā)到幼葉出現(xiàn)期，故未觀察）。使用體視鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司、M205FCA型號）觀察冬芽正視圖和側視圖，手動切片后觀察冬芽橫切面和縱切面的結構變化。

1.4 生理數(shù)據(jù)

使用中通量組織研磨儀（北京鼎昊源科技有限公司，TL-2010S）液氮粉碎樣品。每個處理組的冬芽樣品設3個生物學重復。正式測定之前選擇2～3個預期差異大的樣品做預測定。18 d的樣本已萌發(fā)為新梢，因此未曾檢測相關生理指標，僅用于統(tǒng)計萌芽率。

過氧化氫、超氧陰離子、超氧化物歧化酶、丙二醛、植物淀粉、果糖、植物可溶性糖和雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測定用試劑盒均購于蘇州科銘生物技術有限公司，檢測步驟及數(shù)值計算方法參考試劑盒說明書。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每項生理指標的測定設3個生物學重復。使用Excel進行數(shù)據(jù)整理和繪圖，使用SPSS進行差異顯著性分析。聚類分析利用聯(lián)川生物云平臺（https://www.omicstudio.cn/tool）完成。

2 結果與分析

2.1 外源植物激素對葡萄冬芽萌芽率的影響

統(tǒng)計不同激素處理下葡萄冬芽的萌芽率（圖1）。與對照相比，TIBA促進萌芽，多效唑、氟啶酮和ICA的萌芽率與對照基本一致，ABA、GA7抑制冬芽萌發(fā)。18 d時萌芽率除GA7處理組（63. 93%）外均超過90%。

2.2 體視鏡觀察冬芽萌發(fā)過程

如圖2所示，在體視鏡下觀察不同時期的葡萄冬芽的發(fā)育狀況。0 d時，各組冬芽芽鱗閉合，呈棕黃色，鱗片內(nèi)絨毛排列緊實且厚。6 d時，冬芽開始膨大，芽鱗依舊閉合，但是從冬芽的縱切面來看，芽軸開始伸長并向四周生長，對照組、TIBA、多效唑和氟啶酮處理組冬芽頂端絨毛露出。12 d時，芽鱗破開，冬芽頂端黃色絨毛清晰可見，除ICA、GA7、ABA和氟啶酮處理組仍然看不到冬芽的綠色組織破出鱗片之外，對照組、TIBA和多效唑處理組已可見綠色組織，包被冬芽的絨毛被撐破，切面節(jié)間長度增加。其中GA7處理組冬芽結構變化最小，TIBA處理組冬芽萌發(fā)最旺盛。

2.3 葡萄冬芽萌發(fā)過程中各生理指標的變化

2.3.1 過氧化氫和超氧陰離子含量變化情況

H2O2和OFR是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子。隨著葡萄冬芽發(fā)育H2O2含量先降低后升高（圖3）。各激素處理下H2O2含量6 d時差異不顯著；12 d時激素處理組TIBA、多效唑的H2O2含量偏高，而ICA、氟啶酮、ABA處理后H2O2含量升高較緩，GA7處理下H2O2含量偏低。

隨著葡萄冬芽的發(fā)育，對照組OFR含量先升高后降低，ICA和TIBA處理組的OFR含量下降，GA7、ABA和氟啶酮處理組的OFR含量先降低后升高，多效唑處理組的OFR含量幾乎不變（圖3）。6 d時，處理組的OFR含量都顯著低于對照組；12 d時，除了TIBA處理組外，其他處理組的OFR含量都顯著高于對照組。

2.3.2 SOD酶活性和MDA含量的變化

SOD可以在生物體內(nèi)催化超氧陰離子自由基生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用。檢測冬芽萌芽期間SOD酶活性，發(fā)現(xiàn)其含量隨芽的發(fā)育而逐漸上升（圖4）。與對照相比，6 d時各激素處理下酶活性差異不顯著，ABA處理下酶活性低于對照，其余處理酶活性高于對照；12 d時，多效唑和氟啶酮處理下的冬芽酶活性顯著高于對照，GA7顯著低于對照，其余激素處理下酶活性差異不顯著。相對應的，GA7與ABA處理均顯著降低芽的萌發(fā)率（圖1）。

MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，通過檢測MDA水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平。隨著冬芽的發(fā)育，MDA含量整體呈下降趨勢，但下降幅度不大，說明膜脂過氧化程度較低或清除MDA的能力較強。同時，12 d時ICA、GA7、ABA處理組的冬芽MDA含量分別小于TIBA、多效唑、氟啶酮處理組的冬芽，但各處理組MDA含量的差異不顯著。

2.3.3 糖類物質(zhì)與蛋白質(zhì)含量的變化

隨著冬芽的發(fā)育，植物淀粉含量在下降（圖5），但氟啶酮處理在6 d時淀粉含量比0 d時高，之后淀粉含量下降。與對照組相比，所有激素組處理后的冬芽淀粉含量均高于對照組。

植物可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等，在休眠到萌芽期間，植物淀粉可以轉化為可溶性糖，為植物生長提供可利用的能量。檢測了果糖在休眠到萌芽期間的變化（圖5），隨著葡萄冬芽的發(fā)育，冬芽中的果糖含量先下降后上升。6 d時各組果糖含量達到最低值，各組含量果糖差別不顯著；12 d時果糖含量升高，其中ABA處理組果糖含量最高，TIBA處理組果糖含量最低。隨著葡萄冬芽的發(fā)育，冬芽中的植物可溶性糖含量呈下降趨勢（圖5）。12 d時各激素處理組植物可溶性糖含量都高于對照組。

可溶性蛋白含量可反映植物的代謝水平，葡萄冬芽的可溶性蛋白質(zhì)含量如圖5所示。各組冬芽可溶性蛋白質(zhì)含量總趨勢表現(xiàn)為先下降后上升，其中在6 d時含量最低，隨著休眠的結束，可溶性蛋白含量升高。6 d時ABA處理組可溶性蛋白含量低于對照組，12 d時ABA和氟啶酮處理組蛋白含量低于對照組，其余處理蛋白含量均高于對照組。

2.3.4 聚類分析

不同激素處理組以12 d的8種生理指標進行層次聚類分析表明（圖6），ICA處理組的生理指標成分含量與CK接近；多效唑與氟啶酮處理組可聚為一類；GA7處理組與其他處理組成分含量有較大差異。

3 結論與討論

葡萄冬芽的萌發(fā)是一個漸進的過程，通過觀察各處理組冬芽的外部特征和內(nèi)部結構特征變化，可以判斷冬芽發(fā)育情況。在試驗中，TIBA處理組冬芽的萌芽率高，多效唑、氟啶酮和ICA處理組的萌芽率與對照組基本一致，ABA和GA7處理組萌芽率低于對照組，且GA7處理組萌芽率最低。體視鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TIBA處理組冬芽結構變化最大，萌發(fā)旺盛，而GA7處理組冬芽結構變化最小，內(nèi)部生長緩慢，各結構雖發(fā)育但未成形。

葡萄冬芽內(nèi)的生理指標變化與冬芽休眠的促進和解除有關，該類指標可在一定程度上表征葡萄冬芽的休眠進程。植物組織在自然休眠和休眠解除過程中的活性氧主要有H2O2和OFR等，抗氧化酶主要有SOD。試驗中冬芽萌發(fā)時，TIBA處理提高了H2O2含量，GA7處理降低了H2O2含量。TIBA處理使OFR含量顯著降低，其余處理OFR含量顯著升高。冬芽的發(fā)育使植物體中產(chǎn)生并積累了活性氧，SOD酶活性呈上升趨勢，以保護膜質(zhì)過氧化損害細胞。GA7處理顯著降低了SOD酶活性，而其余處理組SOD酶活性升高。MDA含量反映了植物體脂質(zhì)過氧化的程度。葡萄冬芽MDA含量呈下降趨勢，說明植物體內(nèi)膜脂過氧化程度減小。

糖類物質(zhì)在植物體內(nèi)既是碳源，也是能量的主要來源，也可作為影響芽生長的信號分子[16]。因此，可以從碳水化合物變化的角度來描述休眠釋放和芽萌發(fā)過程。葡萄冬芽在休眠解除的過程中，淀粉含量下降，這與鄭鵬華[17]的研究結果一致。與對照相比，6種激素處理均提高了冬芽的淀粉含量，其中GA7處理組淀粉含量顯著增加。果糖含量先下降后上升，其中ABA處理組果糖含量最高，這與Khalil-Ur-Rehman等[18]的研究結果一致；TIBA和GA7處理降低了果糖含量。孫凌俊等[19]發(fā)現(xiàn)，‘巨峰’葡萄枝條的可溶性糖含量在休眠解除過程中逐漸降低。本試驗中冬芽可溶性糖含量隨著休眠的解除而下降，可溶性糖的快速消耗，表明芽的代謝活性已經(jīng)增強，6種激素處理均可提高冬芽的可溶性糖含量。試驗中可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出先降低再升高的過程，前期的降低可為冬芽打破休眠開始萌發(fā)做物質(zhì)準備，隨著休眠的解除，可溶性蛋白積累以滿足冬芽萌發(fā)的營養(yǎng)需求。試驗中ABA和氟啶酮處理組可溶性蛋白含量降低，其余處理組可溶性蛋白含量增加。

植物激素是調(diào)控植物芽休眠過程的重要內(nèi)部因素。TIBA通過與生長素結合受體抑制生長素的極性運輸，以降低生長素的作用效力，是一種具有微弱生長素作用的抗生長素。本研究中，外源TIBA處理提高了葡萄冬芽的萌芽率，冬芽內(nèi)部結構變化大，冬芽中H2O2含量上升，超氧陰離子含量降低，SOD酶活性升高，植物淀粉含量升高，果糖含量下降，說明在葡萄冬芽生長發(fā)育過程中，外源TIBA處理可以促進葡萄冬芽的生長和發(fā)育。但外源ICA處理對冬芽休眠的解除沒有顯著影響。GA7在葡萄冬芽上的作用則與TIBA正好相反，GA7處理下葡萄冬芽萌芽率降低，冬芽內(nèi)部結構特征變化小，H2O2含量顯著低于其他處理組，超氧陰離子含量上升，SOD酶活性降低。岳海英等[20]在‘紅地球’葡萄上施用赤霉素未發(fā)現(xiàn)有促進冬芽萌發(fā)的作用。Zheng等[11]推測赤霉素在葡萄上的作用是促進芽萌發(fā)后的生長發(fā)育，但對萌芽前休眠的打破存在負面效應。

以上結果表明，葡萄冬芽萌發(fā)過程中其活性氧、保護酶活性和營養(yǎng)物質(zhì)的變化具有一定的規(guī)律性。植物激素參與調(diào)控‘赤霞珠’葡萄冬芽的萌發(fā)，其中，TIBA處理促進葡萄冬芽的萌發(fā)，而GA7處理對冬芽的萌發(fā)表現(xiàn)出抑制作用。