影響‘41B’葡萄體細胞胚誘導因素的研究

張凱，袁昀章，常欣玉，馬靖，劉慧，陳文婷，譚君，楊國順，白描*

（湖南農業大學園藝學院，湖南長沙 410128）

葡萄中體細胞胚（somatic embryo，SE）的誘導是最適宜的轉基因途徑之一[1]，也是誘導體細胞無性系變異的重要策略。體細胞胚可超低溫保存，用于研究胚胎發育以及獲得無病毒植株[2-4]。體細胞胚發生包括胚性細胞（embryonic cell，EC）的獲得、體細胞胚的誘導（somatic embryo induction，SEI）和胚性細胞的維持（embryonic cells maintenance，ECM）等過程。Mullins等[5]于1976年首次報道了‘赤霞珠’采用液體培養進行體細胞胚發生再生植株的方法。Krul等[6]在固體瓊脂培養基條件下，從雜交葡萄‘Seyval’的愈傷組織中獲得了體細胞胚。隨后，其他品種也被證明能夠誘導產生胚性細胞，不同的外植體如葉片、花藥、合子胚、子房和種子等被用于胚性細胞的獲得，并進行體細胞胚的誘導[1,7-8]。在液體培養基中，可以獲得大量體細胞胚，但大多數胚胎表現異常，很難恢復為正常的植株[9-10]。

在葡萄屬植物中，未成熟的花藥是應用最廣泛的外植體，子房和全花也被證明適合體細胞胚發生，而其他外植體很少被使用[11-12]。近年來已經發布了一些體細胞胚發生的方案，其中‘41B’葡萄是早期發現具有很強再生能力的品種。‘41B’為歐美雜交種（Vitis viniferaChasselas×Vitis berlandieri），用其花藥可培養出二倍體細胞。該細胞在懸浮培養中容易形成均勻的細胞團，擴繁培養方便，同時顯示出良好的產生球形和心形胚胎的能力。但隨后胚胎的進一步發育受阻，大部分成為畸形苗，只有少數能發育成正常苗[13]。

為明確‘41B’細胞再生能力的發生條件和作用機理，為其他品種的體細胞胚發生提供參考。本研究比較了不同物質或處理對‘41B’細胞的體細胞胚誘導的影響，對處理后體細胞誘導效率和同步性等進行了檢測，研究結果可加深對限制葡萄體細胞發生因素的認識，也可為葡萄體細胞胚誘導相關研究試驗處理的設置提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究材料

‘41B’胚性細胞分離自其花藥，來自中科院北京植物園代占武實驗室。GM固體基本培養基（GMS）配方和配制方法參考文獻[14]，所用試劑均購自Sigma或索萊寶等公司。其中，植物瓊脂（P1001）、1/2MS大量購自Duchefa；反式玉米素核苷（ZR，Z3541）、6-芐基腺嘌呤（6-BA，B3408）、噻苯隆（TDZ，P6186）、甘油（G5516）、生物素（B4639）、煙酸（N0761）、硫胺素（T4625）、鹽酸吡哆醇（P9755）、肌醇（I7508）均購買自Sigma。活性炭（activated charcoal，AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D，D8100）、萘氧乙酸（NOA，B8400）、透析膜（dialysis membranes，DM，Y1071）、脫落酸（ABA，A8060）、丁酸鈉（NaB，IS0190）、麥芽糖（D8110）和蔗糖均購自索萊寶公司。

1.2 研究方法

‘41B’胚性細胞的維持和擴繁采用GMS+1 mg·L-1NOA（pH=6.8）培養基，置于25 ℃培養箱，黑暗條件下培養。體細胞胚誘導培養條件：將細胞置于25 ℃，光強4000 Lux的培養箱中，光周期為16 h/8 h（光照/黑暗）。

‘41B’細胞在GMS基礎培養基上進行體細胞胚誘導。GMS基礎培養基為：1/2MS＋微量（0.05 mg·L-1生物素＋0.5 mg·L-1硫胺素＋5 mg·L-1煙酸＋0.5 mg·L-1鹽酸吡哆醇＋100 mg·L-1肌醇）＋4.6 g·L-1甘油＋18 g·L-1麥芽糖＋7 g·L-1瓊脂。以GMS為基本培養基，在其基礎上進行設置（表1），化合物濃度（標注）如下：1 g·L-1PVP（P1）；3 g·L-1（AC3）或6 g·L-1（AC6）活性炭；1 mg·L-1或2 mg·L-1的三種不同類型的細胞分裂素（分別標注為ZR1、ZR2；TDZ1、TDZ2；6-BA1、6-BA2）；透析膜（DM）；0.05 g·L-1（NaB0.05）和0.5g·L-1（NaB0.5）的丁酸鈉；0.1 mg·L-1（ABA0.1）或1 mg·L-1（ABA1）脫落酸；添加20 g·L-1蔗糖（S20）或將甘油和麥芽糖替換為20 g·L-1（GMS(-G/M)＋S20）或60 g·L-1（GMS(-G/M)＋S60）蔗糖。

表1 所采用的培養基Table 1 Media used in this study

在超凈工作臺上，接種‘41B’細胞。接種量為每個平板（9 cm×2 cm）接種100 μL細胞（在1 g離心率下沉降），用勺子攤平，直徑約為5 cm。接種細胞后，每天用體視顯微鏡（OLYMPUS，SZX7）進行觀察，并記錄生長狀態。不同類型的細胞狀態不同：‘41B’胚性細胞整體上呈黃色疏散狀，非胚性細胞/愈傷呈現白色透明松軟狀，體細胞胚（球形胚）呈現白色致密球狀。

由于原接種細胞和形成球形胚的數目很難定量，為表征SEI速度和同步性，將形成球形胚占接種細胞面積的百分比來進行觀察統計。每天觀察記錄，重復3次。文中FD：表示開始發現有球形胚時所經歷的天數；FD＞10%：表示當細胞中球形胚達到總體細胞團面積的10%左右時所經歷的天數；FD＞50%：表示當細胞中球形胚達到總體細胞團面積的50%左右時所經歷的天數；RSE/30 d：指培養30 d后球形胚占胚性細胞總體細胞團面積的比率。同時對‘41B’細胞褐化程度進行排序：0代表該細胞狀態良好，所有細胞呈現淡黃色，幾乎沒有褐化；1代表細胞有褐化出現；5代表有一定程度（0～10%）褐化；7代表中度（10.01%～15%）褐化和9代表出現嚴重（＞25%）褐化。

2 結果與分析

2.1 葡萄體細胞胚形成的各個階段

‘41B’體細胞胚誘導過程中不同階段細胞狀態如圖1所示。‘41B’葡萄胚性細胞維持在培養基M1（GMS＋P1＋NOA1）中（圖1A）。在轉入培養基T1（GMS）后，體細胞胚誘導經歷了球形胚（圖1B）、心形胚、魚雷胚和子葉胚（圖1C）以及胚萌發和成苗過程。球形胚為白色致密球狀；體細胞胚發育速度不一致，心形胚、魚雷胚和子葉胚可能同時出現（圖1D）。而在T1培養基上，幾乎所有體細胞胚萌發后都為畸形（圖1E和1F）。

2.2 活性炭和生長素對胚性細胞維持的影響

本研究對影響胚性細胞維持的條件進行了調查，在不同培養基上暗培養30 d后，結果發現：（1）活性炭（AC）除了顯著抑制褐化外，其非選擇性吸附作用對激素濃度的影響顯著。胚性細胞（EC）可以在含生長素的培養基中維持（M2：GMS＋P1＋NOA1或M4：GMS＋P1＋2,4-D1）；但當有3 g·L-1AC存在時，即使含有NOA（1 mg·L-1或4 mg·L-1），EC也極易誘導為SE；而1 mg·L-12,4-D對胚性細胞維持的作用不能被AC抑制（圖2A）。（2）胚性細胞維持過程中不同生長素對后續體細胞胚的誘導影響不同。相對于NOA，2,4-D處理會抑制后續成胚能力（圖2B），這可能與2,4-D在細胞中穩定而難以去除有關。

2.3 不同化合物對‘41B’體細胞胚誘導的影響

在不同處理后，每天記錄各個處理球形胚所占的比例和褐化狀態，持續觀察30 d，統計結果如表2。

2.3.1 活性炭和PVP對葡萄體細胞胚誘導的影響

‘41B’細胞在T1培養基（GMS）中，細胞褐化較嚴重（圖3A）；在添加PVP（T2）后對減輕細胞褐化有一定程度的改善，但不明顯（圖3B）；而添加3 g·L-1（T3）和6 g·L-1（T4）AC，細胞生長狀態良好，幾乎無褐化現象，且相對T2發育速度加快（圖3C和3D）。AC對SEI速度有一定程度的提高（表2）：T2（GMS＋P1）和T3（GMS＋P1＋AC3）處理第12天左右開始成胚，分別培育18 d和21 d后成胚比例達到50%（表2），而T4（GMS+P1+AC6）處理第8天開始成胚，18 d后成胚比例達到50%。

表2 不同化合物或處理對葡萄體細胞胚誘導的影響Table 2 Effects of different compounds or treatments on grape somatic embryo induction

2.3.2 細胞分裂素對葡萄體細胞胚誘導的影響

‘41B’胚性細胞在含有1 mg·L-1或2 mg·L-1三種不同類型的細胞分裂素的培養基中培養發現，細胞分裂素顯著抑制了SEI，且不同類型細胞分裂素具有一定差異（圖3E-J）。ZR對SEI的抑制作用相對弱于6-BA和TDZ。兩個濃度下6-BA和TDZ以及2 mg·L-1的ZR顯著促進非胚性愈傷的形成。

2.3.3 丁酸鈉對葡萄體細胞胚誘導的影響

低濃度NaB（0.05 g·L-1）的處理加速了SE的形成，但對體細胞胚比例無明顯影響（圖3K，表2）。高濃度NaB（0.5 g·L-1）對細胞具有殺傷作用，致使‘41B’細胞死亡（圖3L）。另外，還嘗試了在NaB（0.5 g·L-1）基礎上添加AC（3 g·L-1），發現NaB沒有完全致死細胞，但促進了非胚性細胞的增殖，進而抑制SEI。

2.3.4 透析膜對葡萄體細胞胚誘導的影響

將細胞置于透析膜（DM）上（T11：GMS＋P1＋DM）進行培養，結果發現，體細胞胚出現速度加快，在第8天就有出現；但是在培養10 d后，開始干燥泛白、褐化嚴重，后期體細胞胚無法正常發育（表2，圖3M）；DM外和DM上的胚性細胞有明顯的區別，DM外或其邊緣胚性細胞通過對培養基上營養和水分的吸收，在21 d后開始出現體細胞胚，且部分體細胞胚提前萌發（圖3N），而在DM上的細胞出現脫水現象，這可能與透析膜兩邊，細胞和培養基之間的滲透壓差太大有關。

2.3.5 ABA對葡萄體細胞胚誘導的影響

本研究調查了ABA對SEI的影響。發現隨著濃度提高，ABA對SEI的抑制作用加劇，0.1 mg·L-1和1 mg·L-1ABA可顯著抑制體細胞胚的形成，且抑制后續的萌發（圖3O和3P）；但當有3 g·L-1AC存在時，1 mg·L-1ABA卻加速了部分體細胞胚的萌發（圖3Q）。由于不能確定AC濃度與吸附效率的關系，加上其吸附作用可能沒有選擇性，因此很難判斷ABA的有效濃度。與未加ABA的對照（T2，圖3B）比較，低濃度的ABA可能促進體細胞胚的萌發。

2.3.6 不同碳源及濃度對葡萄體細胞胚誘導的影響

GMS中碳源為麥芽糖和甘油，本研究以20 g·L-1蔗糖替換該碳源（T17：GMS(-G/M)＋S20＋P1），結果發現SEI起始沒有明顯加快，但后期速度加快，體細胞胚出現更加同步；不過有部分體細胞胚發育加快，且有明顯的褐化（表2，圖3R）。在T17基礎上添加AC后（T18），形成體細胞胚速度減慢，體細胞胚形成的同步性變差，且伴隨部分非胚性細胞的增殖（表2，圖3S）；而當蔗糖提高到60 g·L-1，SEI速度加快，且體細胞胚形成的同步性顯著提高，SE呈乳白色，后續觀察發現萌發速度顯著減慢（表2，圖3T）。

3 討論與結論

在SEI過程中，各種培養條件和化合物的使用被提及。首先，生長素被證明是胚性細胞維持的關鍵，而外源生長素去除是SEI的關鍵。在高濃度的生長素處理下，一些特定的細胞有機會獲得再生能力，隨后降低生長素濃度有利于胚性細胞誘導為體細胞胚[15-16]。‘41B’主要使用NOA進行胚性細胞的維持，而我們使用2,4-D進行比較發現，2,4-D處理會使細胞（團）形態發生變化，后續成胚能力受到嚴重抑制，這可能與2,4-D穩定不易遷移難以去除有關，也可能與不同類型生長素的作用機制差異有關。

在SEI過程中細胞褐化的抑制很重要。添加PVP和AC是細胞培養中防止褐化的重要手段[17]。但本研究發現，PVP對于‘41B’細胞褐化抑制效果并不明顯，而AC效果顯著。另外，AC也顯著提高了SEI的速度和一致性，暗示AC可能吸附了一些抑制SEI的物質。在SEI過程中，眾多研究都有添加AC的習慣，反而導致AC對SEI的關鍵作用被忽略[13,18]。本研究再次強調了AC在SEI中的重要性，同時需要注意由于AC的非選擇性吸附，培養基中激素等添加物的有效濃度可能與無AC添加的培養基不同，其具體影響程度需要進一步研究。

前人研究發現，添加細胞分裂素有利于細胞再生[19]，甲基化的去除可調控眾多再生相關的基因。研究顯示，采用組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑NaB，對葡萄體細胞胚形成具有積極作用[20]。另外，水分的有效性對誘導體細胞胚很關鍵。體細胞胚的成熟與其儲備產物的積累和干燥度有關。研究發現，透析膜的使用可以減少水分的可用性，顯著提高柑橘和葡萄等體細胞胚的誘導率[21]；高濃度蔗糖和ABA的使用也可能調節水分的利用，從而促進體細胞胚的形成，而且ABA被證明能減輕體細胞胚的畸形率[22]。

在本研究中發現，不同類型細胞分裂素都對‘41B’細胞的再生沒有積極作用，還會促進非胚性細胞的增殖。這提示，由基因型決定的具有高再生能力的葡萄類型或品種，無需細胞分裂素進行體細胞胚誘導。這可能與內源細胞分裂素濃度有關，但具體原因還有待證實。本研究發現，低濃度NaB可能促進體細胞胚的形成，但高濃度NaB可使細胞白化死亡。這暗示對組蛋白去乙酰化酶的強烈抑制，可能對細胞造成不可逆的損傷，在對其他種類或品種葡萄使用時應注意其濃度。另外，‘41B’葡萄的SE萌發后幾乎都是畸形。這與前人研究結果不同[22]，ABA對降低‘41B’葡萄SE的畸形率沒有明顯作用。

在SEI過程中，高濃度ABA抑制體細胞胚的形成和萌發，但在AC存在情況下，低濃度ABA則可能促進體細胞胚的萌發。AC對各類化合物可能具有非選擇性吸附，從而降低其有效利用率，這對試驗結果造成不可預測的影響，需引起重視。

最后，本研究發現，水分的利用對體細胞胚的形成影響顯著，DM或高濃度的蔗糖都可能影響了水分的利用。但是，持續處于DM上的細胞容易過度失水，進而影響體細胞胚的發育；而高濃度的蔗糖可提高體細胞胚的誘導效率和其生長的同步性。綜上，活性炭和蔗糖的利用有利于葡萄體細胞胚的誘導，具有進一步深入研究的價值。