‘玫瑰香’葡萄組培生根期愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組分析

李光宗，韋偉，許文娣，單守明*

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

玫瑰香（Muscat Hamburg）又名麝香，原產(chǎn)于英國，歐亞種，屬中晚熟品種，作為具有鮮食、釀酒、制汁等功能的優(yōu)質(zhì)品種在我國廣泛栽培[1-2]。目前葡萄繁殖方式主要以壓條、扦插、嫁接為主，其中扦插繁殖應(yīng)用廣泛[3-4]，然而生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)扦插成苗率低，不定根數(shù)量少，且根系生長弱，影響葡萄的繁殖效率。此外，長期采取扦插繁殖方式，會造成嚴(yán)重的退化現(xiàn)象[5]。

近年來，葡萄組培快繁相關(guān)研究取得了重大進(jìn)展，不但能夠縮短苗木的繁育周期，而且可培養(yǎng)出根系好、枝條粗壯的苗木[6]。生根培養(yǎng)是組織培養(yǎng)體系中的主要步驟，培養(yǎng)基的類型及其中附加的激素如IAA、IBA、6-BA、KT和NAA等影響組培苗的生長[6-7]。生根培養(yǎng)中，IBA和NAA在促進(jìn)生根中發(fā)揮著重要作用[4]。目前對于‘玫瑰香’葡萄組織培養(yǎng)的相關(guān)研究較少，且多集中于組培快繁體系建立方面，本研究將探究不同激素配比對‘玫瑰香’葡萄生根的作用。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)具有高通量、低成本、高效率等特點(diǎn)，利用RNA-Seq可以有效了解基因的功能和結(jié)構(gòu)，揭示器官及細(xì)胞在特定生物學(xué)過程中的機(jī)制[12]。Illumina轉(zhuǎn)錄組測序平臺，可進(jìn)行多個樣品同時測序，且測序結(jié)果具有良好的順序性和精確性，是應(yīng)用較為廣泛的測序平臺[13]。目前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用于葡萄的許多方面，如‘溫克’葡萄氣生根[14]、‘夏黑’葡萄葉片衰老[15]、補(bǔ)光對‘紅地球’葡萄萌芽[16]及葡萄糖對‘紅地球’葡萄試管苗光合作用的影響[17]等，而對于葡萄組培苗愈傷組織轉(zhuǎn)錄組測序的相關(guān)研究較少。本研究對‘玫瑰香’葡萄組織培養(yǎng)至生根階段，篩選出較為合適的培養(yǎng)基類型，通過不同處理選定轉(zhuǎn)錄組測序材料，并對測序結(jié)果進(jìn)行分析，以期探究‘玫瑰香’葡萄生根的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

組培所用外植體為‘玫瑰香’葡萄帶芽莖段，于2021年7月在寧夏銀川平吉堡釀酒葡萄示范園內(nèi)獲取。‘玫瑰香’葡萄7年生，“廠”形架式，南北行向，株行距為1.0 m×3.0 m，葡萄園基礎(chǔ)管理一致。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

將‘玫瑰香’葡萄帶芽莖段取回實(shí)驗(yàn)室，立即用流水充分沖洗10 min。在超凈工作臺上，用70%的乙醇溶液浸泡并輕晃消毒45 s，倒出乙醇后使用無菌水清洗3次，之后采用15%的H2O2溶液充分浸泡消毒6 min，取出后，再次用無菌水沖洗4次。

1.2.2 啟動培養(yǎng)

將制備好的外植體以斜角約45°切去兩端5 mm，然后接種到培養(yǎng)基中。啟動培養(yǎng)基為：MS＋1.0 mg·L-16-BA＋0.2 mg·L-1NAA＋30 g·L-1蔗糖＋7 g·L-1瓊脂。培養(yǎng)條件為：日光照時間16 h，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2500 Lx。

1.2.3 生根培養(yǎng)基篩選

等到初代培養(yǎng)的帶芽莖段芽萌發(fā)且長至5 cm左右時，通過超凈工作臺將長勢均一的萌發(fā)枝條切取并轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，每瓶接1個莖段。生根培養(yǎng)基的篩選：采用0.3 mg·L-1IBA＋0.3 mg·L-1NAA＋25 g·L-1蔗糖＋7.5 g·L-1瓊脂，對1/2MS、1/2B5、B5、1/2WPM、WPM和N6培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。培養(yǎng)條件為：日光照時間12 h，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2500 Lx。各培養(yǎng)基類型分別設(shè)10個樣本。于15 d后統(tǒng)計不同培養(yǎng)基中組培苗的生根情況，進(jìn)而計算平均生根數(shù)和生根率（未生根的組培苗不做統(tǒng)計）。

1.2.4 生根培養(yǎng)

選定用于生根的基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，采用IBA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1）、NAA（0.1、0.3、0.5 mg·L-1）和蔗糖（15、25、35 g·L-1）各3個濃度進(jìn)行處理，設(shè)計正交試驗(yàn)（表1），共計9組，每組10個樣本，各培養(yǎng)基瓊脂濃度7.5g·L-1。培養(yǎng)條件為：日光照時間12 h，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2500 Lx。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design

當(dāng)莖基部愈傷組織開始生出根系，且根系數(shù)目增長較快時，將基部愈傷組織取下并切去周圍雜質(zhì)，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序分析和熒光定量驗(yàn)證。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

1.3.1 RNA提取及測序

愈傷組織總RNA的提取參照TIANGEN RNA提取試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行。每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)，使用NanoDrop 2000測定RNA的提取質(zhì)量，并結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，以確保后續(xù)分析的需要。參考劉帥[12]等人的方法構(gòu)建cDNA文庫并進(jìn)行質(zhì)檢，將已構(gòu)建好的cDNA文庫通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司在Illumina Novaseq 6000測序平臺上測序。

1.3.2 測序數(shù)據(jù)分析

利用Sickle和SeqPrep軟件處理測序所獲得的原始數(shù)據(jù)（Raw reads），從而獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)（Clean reads）。將Clean reads通過HISAT2軟件與參考基因組進(jìn)行比對分析，獲得用于后續(xù)表達(dá)量計算等的mapped reads。采用RSEM軟件對基因表達(dá)進(jìn)行定量，以FPKM為單位，｜log2FoldChange｜≥1、P-adjust＜0.05為篩選條件，統(tǒng)計基因顯著性差異表達(dá)情況（DEGs）。進(jìn)而進(jìn)行GO功能分類、COG功能注釋及KEGG相關(guān)分析，當(dāng)P-value＜0.05時，認(rèn)為KEGG富集功能存在顯著富集情況。

1.3.3 差異基因的熒光定量驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，隨機(jī)選出6個差異表達(dá)基因，使用CWBIO熒光定量試劑盒做qRT-PCR 驗(yàn)證。以VvEF基因（登錄號：AF176496）作為內(nèi)參，通過2-△△CT算法計算基因相對表達(dá)量。各反應(yīng)3次重復(fù)，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計引物，引物序列見表2。

表2 qRT-PCR基因引物序列Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 生根培養(yǎng)基篩選及測序樣品選擇

由表3可知，1/2B5培養(yǎng)基組生根率最高，達(dá)到了100%，且平均生根條數(shù)為6.2；其次為1/2WPM組，其生根率為80%。B5培養(yǎng)基組平均生根數(shù)為6.6，生根率為60%。綜合各培養(yǎng)基平均生根數(shù)和生根率數(shù)據(jù)，選擇1/2B5培養(yǎng)基為生根培養(yǎng)基。

表3 不同培養(yǎng)基生根指標(biāo)Table 3 Rooting index of different media

圖1為生根處理20 d生根情況，M6的主根數(shù)和側(cè)根數(shù)顯著高于其他各組，而M1的主根數(shù)最少，且與側(cè)根數(shù)目最少的M2相差較少，因此選擇生根差異較大的M1與M6的根基部愈傷組織作為轉(zhuǎn)錄組測序材料。

2.2 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計

利用Illumina Novaseq 6000測序平臺對6個樣品測序，共得到42.86 Gb Clean data，各樣品Clean data均達(dá)到5.49 Gb以上。將Raw reads過濾后，各樣品Q20和Q30百分比分別在97.95%與93.85%以上，GC含量為45.93%～46.49%，表明測序質(zhì)量較好，可以用于進(jìn)一步比對分析（表4）。

表4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計Table 4 Statistics of sequencing data quality

2.3 RNA-Seq測序數(shù)據(jù)與參考序列比對

利用HISAT2軟件將Clean reads與參考基因組進(jìn)行比對分析。比對分析結(jié)果顯示（表5），各樣品8 8.2 3%以上的C l e a n r e a d s能定位到參考序列，其中有多個比對位置的為2.6 9%～3.3 9%，唯一位置的比對效率為85.27%～88.2%。而比對到基因組上的Clean reads在參考基因組編碼區(qū)域的分布情況為84.2%～85.68%。各項(xiàng)數(shù)據(jù)表明可以進(jìn)行后續(xù)分析。

表5 Clean reads與參考基因組比對統(tǒng)計Table 5 Statistics of clean reads and reference genome comparison

2.4 差異表達(dá)基因的篩選

以｜log2FoldChange｜≥1、P-adjust＜0.05為篩選條件，統(tǒng)計基因顯著性差異表達(dá)情況（圖2）。結(jié)果表明，在M1 vs M6中共篩選到52個DEGs，其中下調(diào)基因35個，上調(diào)基因17個，DEGs的差異倍數(shù)大多集中在-6～8之間，這些DEGs以下調(diào)表達(dá)為主。

2.5 差異基因GO功能分類

GO功能分類體系包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3大類，對差異基因進(jìn)行GO功能分類，共有52個差異基因被注釋到26個GO功能類別中。圖3為GO功能注釋條目表，其中在生物過程功能體系中，主要包括代謝過程、細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)等條目；在分子功能體系中，主要包括催化反應(yīng)活性、蛋白結(jié)合等條目；而在細(xì)胞組分體系中，主要包括細(xì)胞部分、細(xì)胞膜部分等條目。差異基因在生物過程中注釋到的條目較多，主要注釋到代謝過程、細(xì)胞過程和生物調(diào)節(jié)3個類別中；其次為細(xì)胞組分，基因主要集中于細(xì)胞和細(xì)胞膜部分；而分子功能體系中，基因主要富集于催化反應(yīng)活性和蛋白結(jié)合功能中（表6）。

表6 差異基因GO功能統(tǒng)計Table 6 Statistics of DEGs GO function

2.6 差異基因COG功能注釋分析

愈傷組織差異表達(dá)基因根據(jù)COG注釋功能分類，可分為信息存儲和處理、代謝、細(xì)胞過程和信號以及表達(dá)不明顯4大類，涉及12條功能分類（圖4）。其中，樣品注釋到未知功能（S, 22）的基因數(shù)最多；其次為次生代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝相關(guān)基因（Q, 9）和碳水化合物運(yùn)輸和代謝（G, 9）；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生（J, 3），而較少注釋到脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝（I, 1）以及防御機(jī)制（V, 1）等相關(guān)基因條目。

2.7 差異基因KEGG分析

為進(jìn)一步研究差異基因所具有的生物學(xué)功能，進(jìn)行了KEGG注釋分析，共有22個基因參與了14條KEGG通路（圖5），共分為代謝、遺傳信息處理、有機(jī)系統(tǒng)3大類。其中DEGs注釋最多的為碳水化合物代謝，其次為其他次生代謝物的生物合成；注釋最少的為環(huán)境適應(yīng)等。

對差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，碳水化合物代謝中的氨基糖和核苷酸糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化通路；次生代謝物生物合成中的黃酮類生物合成和異黃酮生物合成4個通路顯著富集，各通路中差異基因均為下調(diào)，基因數(shù)目分別為3、2、2、1（圖6）。

2.8 生根階段愈傷組織中差異基因表達(dá)分析

圖7為顯著富集通路中的差異基因表達(dá)熱圖，圖中紅色代表高表達(dá)基因，藍(lán)色代表低表達(dá)基因。由圖7可以看出，‘玫瑰香’葡萄組培苗基部生根愈傷組織顯著富集通路中的8個差異表達(dá)基因均在M1中上調(diào)表達(dá)，而在M6中都下調(diào)表達(dá)。其中氨基糖和核苷酸糖代謝通路富集于細(xì)胞壁大分子物質(zhì)分解過程，包括3個幾丁質(zhì)酶基因（VIT_05s0094g00220、VIT_05s0094g00230、VIT_05s0094g00360）；而戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化通路主要富集于果膠分解過程，為2個果膠酯酶基因（VIT_07s0005g00720、VIT_16s0022g00700）；在黃酮類生物合成通路中分別篩選出1個氧化還原酶基因（VIT_06s0009g03040）和1個查爾酮合酶（CHS）家族基因（VIT_16s0100g01120）；異黃酮生物合成中為甲基轉(zhuǎn)移酶基因（VIT_10s0003g00470）。

2.9 差異基因的熒光定量驗(yàn)證

為了驗(yàn)證 RNA-seq 數(shù)據(jù)的真實(shí)可靠性，隨機(jī)選取6個DEGs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證（圖8）。進(jìn)一步將驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，6個基因的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析的相關(guān)系數(shù)較高（0.943），并且表達(dá)趨勢基本一致，表明RNA-seq分析結(jié)果真實(shí)可靠。

3 討論與結(jié)論

近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)日益興起，其在發(fā)掘差異基因表達(dá)模式及調(diào)控機(jī)理方面發(fā)揮了重要作用[18]。本試驗(yàn)篩選出較適合‘玫瑰香’葡萄生根的培養(yǎng)基類型為1/2B5，之后通過正交設(shè)計以不同濃度IBA、NAA和蔗糖進(jìn)行處理，并對組培苗基部生根愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析.Illumina Novaseq 6000測序結(jié)果表明，測序質(zhì)量及質(zhì)控結(jié)果較好，共得到42.86 Gb Clean data，約88.23%以上的Clean reads能定位到參考序列。測序結(jié)果共獲得52個DEGs，主要以下調(diào)表達(dá)為主。因此，數(shù)據(jù)基本能夠反應(yīng)基部生根愈傷組織轉(zhuǎn)錄組特征，為進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)參考。而對于所篩選DEGs較少的原因，推測可能為大多數(shù)基因在M1和M6兩個生根階段差異表達(dá)不明顯。

GO功能注釋表明，根基部愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組特性與生物過程、細(xì)胞組分和分子功能相關(guān)；COG功能分析根據(jù)物種所屬的clade選擇參考數(shù)據(jù)集，充分展示了與其它注釋信息（KEGG/GO）的關(guān)聯(lián)[19]。本研究共得到12個不同的功能條目，差異基因主要注釋到次生代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝以及碳水化合物運(yùn)輸和代謝中。進(jìn)一步對差異基因序列進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果表明，碳水化合物代謝中的氨基糖和核苷酸糖代謝通路以及戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化通路、次生代謝中的黃酮類和異黃酮生物合成通路在KEGG代謝通路中顯著富集，KEGG分析結(jié)果在一定程度上可以說明生根愈傷組織相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在本試驗(yàn)中體現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)生物學(xué)過程，啟動如碳水化合物代謝、次生代謝物合成等KEGG通路響應(yīng)[20]。以往研究表明，經(jīng)過不同條件處理，植物差異基因所富集通路也不相同。對NaCl脅迫下新疆野蘋果葉和根轉(zhuǎn)錄組分析顯示，差異基因主要富集在糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑和果糖和甘露糖代謝等[21]；在Cd脅迫處理后番茄根的轉(zhuǎn)錄組分析中，差異基因在植物MAPK信號通路、苯丙酸生物合成和植物-病原菌互作等通路富集程度較高[22]；而在IBA誘導(dǎo)楸樹扦插不定根轉(zhuǎn)錄組分析中，大量的差異基因則富集在苯丙烷合成、糖酵解和植物激素代謝等途徑中[23]。由此可見，不同處理下植物轉(zhuǎn)錄組測序得到的差異基因富集通路差異較大，充分體現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄組對不同環(huán)境下植物生長響應(yīng)的差別反應(yīng)。

碳水化合物代謝是植物最基礎(chǔ)也是最重要的生命活動代謝[24]，在本研究中也是‘玫瑰香’葡萄愈傷組織中響應(yīng)最顯著的代謝通路。其中涉及差異基因最多的為氨基糖和核苷酸糖代謝途徑，主要富集了幾丁質(zhì)酶基因。植物幾丁質(zhì)酶主要在植物細(xì)胞壁中進(jìn)行合成，并在植物的防御、發(fā)育和生長調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[25-26]。而戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化通路富集了果膠酯酶（Pectinesterase,PME）基因，果膠酯酶通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來調(diào)控細(xì)胞生長[27]，PME屬于大型多基因家族，其對植物根系發(fā)育存在影響[28]。梁國平[29]等研究發(fā)現(xiàn)，豌豆根尖PME基因的表達(dá)與根邊緣細(xì)胞的游離緊密相關(guān)，因此會抑制根邊緣細(xì)胞的正常游離。本研究表明，兩條代謝通路中富集的相關(guān)基因在M1中上調(diào)表達(dá)，而在M6中均下調(diào)表達(dá)，可能受到試驗(yàn)中高濃度蔗糖或激素的影響。目前，尚未有關(guān)于氨基糖和核苷酸糖代謝以及戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化兩條途徑在植物生根中發(fā)生作用的相關(guān)報道，但在白鮮、新疆野蘋果、番茄等[30,21-22]植物根系轉(zhuǎn)錄組中均有富集，因此本研究推測其可能通過影響植物細(xì)胞壁來進(jìn)行生命活動，而關(guān)于其具體作用需要進(jìn)一步的研究。

植物的次生代謝產(chǎn)物在提高自身保護(hù)和生存競爭能力以及協(xié)調(diào)與周圍環(huán)境關(guān)系上起著至關(guān)重要的作用[31]。本研究中次生代謝通路主要富集于黃酮類和異黃酮生物合成兩條通路中。黃酮類物質(zhì)是一種重要的次生代謝物，在植物中不僅參與花、果實(shí)、種子的形成和發(fā)育，而且還具有抵御生物或非生物脅迫的作用[32]。試驗(yàn)中有1個基因注釋到查爾酮合酶（CHS），該酶是黃酮合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶[33]，對于黃酮類物質(zhì)的合成具有重要的作用。兩條次生代謝物合成通路中富集的基因在M1中上調(diào)表達(dá)，而在M6中均下調(diào)表達(dá)，其可能在適應(yīng)局部環(huán)境，響應(yīng)高濃度的處理中發(fā)揮著重要作用。

本研究對‘玫瑰香’葡萄組織培養(yǎng)中生根培養(yǎng)基的類型進(jìn)行篩選，認(rèn)為1/2B5培養(yǎng)基具有較高的生根率；之后以不同濃度蔗糖、NAA和IBA進(jìn)行處理，結(jié)果1/2B5＋I(xiàn)BA0.5 mg·L-1＋NAA0.5 mg·L-1＋蔗糖25 g組合具有較高的生根率和主根數(shù)。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析表明，‘玫瑰香’葡萄細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變可能是其生根發(fā)育調(diào)控機(jī)理之一，而次生代謝物合成在‘玫瑰香’葡萄生根適應(yīng)局部環(huán)境以及協(xié)作生根中具有重要作用，研究生根相關(guān)的基因及其功能初步為‘玫瑰香’葡萄生根的分子機(jī)理提供參考信息。