基于成分的三七質(zhì)量分析研究

吳 嵐，韋柳衛(wèi)，韋錦梅，鐘 文，譚雨坪

（1.梧州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 梧州 543002；2.南寧市第六人民醫(yī)院，南寧 530003；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200）

中藥三七為五加科多年生草本植物三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］的干燥根及根莖［1］，別名有田七、參三七（山漆）、金不換等［2］，主要產(chǎn)于中國的廣西壯族自治區(qū)、云南省等地。三七有止血神藥、傷科要藥之稱，屬于化瘀止血藥類，具有化瘀止血、消腫定痛功效，并有止血不留瘀，化瘀不傷正的特點(diǎn)［3］。

三七的傳統(tǒng)干燥工藝主要有窯洞烘烤和自然晾曬，操作雖簡(jiǎn)便，但過高的烘烤溫度會(huì)降低三七中有效成分的含量且質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制［4］。近年來，隨著中藥材干燥技術(shù)的改進(jìn)，冷凍干燥法和熱風(fēng)干燥法被作為三七干燥的主要方法。質(zhì)量及藥效，采用基于成分評(píng)價(jià)的方法，對(duì)三七藥材進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與傳統(tǒng)飲片（熱風(fēng)干燥法）進(jìn)行比較，以期為三七飲片的標(biāo)準(zhǔn)制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)儀器

Agilent 1260型液相色譜（美國安捷倫科技有限公司）、XN06-IV型凝血儀（武漢景川診斷技術(shù)股份有限公司）、K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀（濟(jì)南海能儀器股份有限公司）、UV-1800型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試驗(yàn)藥材

中藥三七購于廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)謝臻副教授鑒定，為五加科植物三七的干燥根和根莖。

1.3 試驗(yàn)材料

三七皂苷R（1批號(hào)110745-201921）、人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-202034）、人參皂苷Re（批號(hào)110754-202129）、人參皂苷Rb（1批號(hào)110704-202129）、人參皂苷Rd（批號(hào)111818-202104）、蘆丁（批號(hào)100080-202012）、沒食子酸（批號(hào)110831-201906）對(duì)照品，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 藥材處理

3種干燥方法的工藝流程如表1所示，鮮三七原料源自同一批次三七，隨機(jī)分成3份進(jìn)行干燥處理，干燥至含水量2%以下。

表1 三七不同干燥加工方法

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 三七5種皂苷含量測(cè)定

1）對(duì)照品溶液制備。精密稱定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd對(duì)照品適量，以70%乙醇溶解稀釋成不同濃度的溶液，在波長(zhǎng)203 nm處測(cè)定峰面積。

2）供試品溶液制備。稱取三七樣品粉末1.0 g，加入70%乙醇溶液25 mL，超聲提取40 min，過濾離心，合并2次提取液定容至25 mL，用0.45 μm濾膜過濾，得到供試品溶液。

3）色譜條件。色譜柱：Agilent Zorbax型SB-C18（5 μm，4.6 mm×250.0 mm）；流動(dòng)相：乙腈（A），水（B）；梯度洗脫程序?yàn)?～18 min：20%A，18～42 min：45%A，42～52 min：54%A，52～60 min：56%A；檢 測(cè) 波 長(zhǎng) ：203 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

1.5.2 三七多糖含量測(cè)定

1）對(duì)照品溶液制備。精密稱取適量無水葡萄糖，加水稀釋至不同濃度置25 mL比色管中，依次加入1 mL 6%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，混勻，放置至室溫，在L=1 cm、波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。

2）供試品溶液制備。稱取三七粉末樣品2.0 g，按料液比1∶25加入去離子水超聲40 min，離心取上清濾液；取濾渣加同比例的水，75℃水浴1 h，3 500 r/min離心12 min，合并上清液，靜置抽濾。上清液除蛋白和冷凍干燥方法參考文獻(xiàn)［5］。

3）總多糖含量測(cè)定。精密稱取凍干樣品5 mg加水定容至50 mL，精密吸取1 mL置于25 mL比色管中，依次加入水、6 %的苯酚溶液各1 mL，搖勻后加入5 mL濃硫酸，混勻，放置至室溫，在L=1 cm、波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。

1.5.3 三七總黃酮和總酚含量測(cè)定

1）對(duì)照品溶液制備。精密稱取適量的蘆丁、沒食子酸對(duì)照品，加入乙醇稀釋成不同濃度，分別在510、273 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

2）供試品溶液制備。稱取三七樣品0.5 g，70 %乙醇，超聲30 min，離心取上清液，重復(fù)提取2次，合并上清液定容至25 mL，得供試品溶液。

3）總黃酮和總酚含量測(cè)定。取上述供試品溶液1 mL，加入70%甲醇4 mL，以5 mL 70%甲醇作為空白對(duì)照，在L=1 cm、波長(zhǎng)256、273 nm處測(cè)定吸光度。

1.5.4 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析、主成分分析和雙變量相關(guān)性分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。對(duì)相同指標(biāo)不同處理進(jìn)行Duncan 0.05多重分析，采用Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 5種皂苷類成分方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的RSD分別為1.05%、1.20%、0.89%、1.52%、1.86%；重復(fù)性試驗(yàn)：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的RSD分別為0.92%、1.21%、1.35%、1.72%、0.95%；穩(wěn)定性試驗(yàn)：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd在0、2、4、6、8、12、24 h的RSD分別為1.28%、2.05%、1.62%、1.90%、1.62%；加樣回收率試驗(yàn)：三七皂苷R1、人參皂 苷Rg1、Re、Rb1、Rd的 平 均 加 樣 回 收 率 分 別 為100.05%、98.40%、97.85%、99.06%和100.12%，RSD分別為2.50%、1.89%、2.61%、1.98%和2.12%。

2.1.2 總多糖、總黃酮、總酚方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：總多糖、總黃酮、總酚的RSD分別為1.78%、2.05%、1.64%；重復(fù)性試驗(yàn)：總多糖、總黃酮、總酚的RSD分別為1.83%、2.02%、1.47%；穩(wěn)定性試驗(yàn)：總多糖、總黃酮、總酚在0、2、4、6、8、12、24 h的RSD分別為2.30%、1.85%、2.26%；加樣回收率試驗(yàn)：總多糖平均加樣回收率為98.75%，RSD為2.40%。總黃酮平均加樣回收率為98.62%，RSD為2.48%。總酚平均加樣回收率為100.42%，RSD為2.15%。

2.2 高效液相色譜

對(duì)照品溶液和三七樣品溶液的高效液相色譜見圖1。由圖1可知，各成分分離度良好。

圖1 對(duì)照品溶液（a）和三七樣品溶液（b）的高效液相色譜

2.3 三七5種皂苷含量測(cè)定結(jié)果

以檢測(cè)濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程分別為R1：y=2 486.9x+18.512（r2=0.999 5）；Rg1：y=3 210.2x-2.645（r2=0.999 8）；Re：y=3 369.8x+6.526（r2=0.999 3）；Rb1：y=22 519.2x-3.581（r2=0.999 5）；Rd：y=3 379.8x-0.952（r2=0.999 2）。結(jié)果表明，在0.448～0.028 mg/mL水平上，各皂苷與峰面積線性關(guān)系良好。

皂苷類成分含量測(cè)定結(jié)果見表2。從表2可以看出，80℃熱風(fēng)干燥的三七R1含量顯著高于60℃熱風(fēng)干燥、冷凍干燥的三七，Rg1、Rb1、Rd以及總皂苷含量均顯著低于冷凍三七粉；總皂苷含量：冷凍干燥三七＞60℃熱風(fēng)干燥三七＞80℃熱風(fēng)干燥三七。冷凍干燥的三七與60℃熱風(fēng)干燥三七相比，Rg1、Rb1含量顯著提高8.37%、6.33%，R1含量降低2.48%，冷凍干燥三七中Re和Rd含量高于60℃熱風(fēng)干燥的三七，但無顯著差異。

表2 皂苷類成分含量測(cè)定結(jié)果（，n=3） （單位：%）

表2 皂苷類成分含量測(cè)定結(jié)果（，n=3） （單位：%）

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。表3同

處理S1 S2 S3 R1 1.21±0.08 c 1.36±0.06 a 1.18±0.12 bc Rg1 4.18±0.82 bc 3.94±0.15 b 4.53±0.60 a Re 0.41±0.030 a 0.46±0.012 a 0.49±0.018 a Rb1 3.32±0.48 b 3.15±0.71 c 3.53±0.36 a Rd 0.75±0.54 a 0.66±0.13 b 0.78±0.25 a總皂苷9.76±1.21 c 9.54±1.54 bc 10.60±2.28 a

2.4 三七總多糖、總黃酮、總酚和總蛋白含量測(cè)定結(jié)果

以檢測(cè)濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程分別為多糖：y=12.750x+0.098 0（r2=0.999 1）；總黃酮：y=24.526x+0.086 2（r2=0.999 2）；總 酚 ：y=32.685x+0.049 2（r2=0.999 4）。結(jié)果表明，在12.0～72.0 μg/mL水平上，多糖與吸光度線性關(guān)系良好，在2.5～15.0 μg/mL水平上，總黃酮、總酚酸和吸光度線性關(guān)系良好。

經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè)結(jié)果見表3。如表3所示，其中冷凍干燥的三七總黃酮含量顯著低于其他2種干燥方式，總酚含量顯著低于60℃熱風(fēng)干燥方式，60℃熱風(fēng)干燥的三七總多糖含量顯著高于其他2種干燥方式。

表3 三七總多糖、總黃酮、總酚和總蛋白含量測(cè)定結(jié)果（n=3） （單位：mg/g）

2.5 主成分分析

采用主成分分析法考察干燥方式與成分之間的相關(guān)性，如表4、表5所示，以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、總皂苷、總多糖、總黃酮、總酚為考察指標(biāo)，分別對(duì)3種干燥粉進(jìn)行分析。共提取出特征值大于1的2個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率高達(dá)97.677%，具有較強(qiáng)的代表性，能夠客觀反映不同干燥處理的三七飲片的內(nèi)在品質(zhì)。故選用上述2個(gè)成分對(duì)干燥飲片進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

表4 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率

表5 主成分相關(guān)系數(shù)

結(jié)合主成分特征值和9個(gè)成分的相關(guān)系數(shù)，得到2個(gè)主成分方程：Y1=0.405X1-0.293X2+0.402X3+0.201X4+0.394X5+0.256X6-0.076X7-0.375X8-0.158X9，Y2=0.016X1-0.356X2+0.038X3-0.445X4+0.108X5+0.398X6+0.504X7+0.184X8+0.472X9，其 中X1（ 總 皂苷）、X（2R1）、X（3Rg1）、X（4Re）、X（5Rb1）、X（6Rd）、X7（總多糖）、X（8總黃酮）、X（9總酚）分別代表原始變量標(biāo)準(zhǔn)化后的變量。主成分Y1與總皂苷、Rg1、Rb1、Re、Rd成正相關(guān)，貢獻(xiàn)值為60.185%；主成分Y2與總皂苷、Rg1、Rb1、總黃酮、總多糖、總酚、Rd呈正相關(guān)，貢獻(xiàn)值為37.492%。根據(jù)公式Z（綜合評(píng)分）=60.185%Y1+37.492%Y2，得出三七的綜合評(píng)分，結(jié)果見表6。基于主成分分析和綜合得分結(jié)果得出，80℃熱風(fēng)干燥三七粉綜合水平最高，質(zhì)量最優(yōu)。

表6 三七樣品主成分分析綜合得分

3 討論

試驗(yàn)中，80℃熱風(fēng)干燥與冷凍干燥相比在生產(chǎn)過程中縮短了加工時(shí)間，主成分總多糖、總黃酮和總酚得以保留，具有顯著差異性（P＜0.05）。但是冷凍干燥法與熱風(fēng)干燥法相比，對(duì)熱敏成分影響較小，可顯著減少皂苷的流失（P＜0.05）。冷凍干燥的三七與60℃熱風(fēng)干燥的三七相比，Rg、Rb含量顯著提高8.37%、6.33%，Re和Rd含量高于熱風(fēng)干燥的三七。本試驗(yàn)在3種加工方法對(duì)5種單體皂苷含量的測(cè)定過程中發(fā)現(xiàn)，熱風(fēng)干燥的三七R1含量高于冷凍干燥，其他單體皂苷成分含量不同程度地少于冷凍干燥方式，所以在熱風(fēng)干燥工藝環(huán)境下發(fā)生了部分皂苷的轉(zhuǎn)變。不同處理方式引起的成分變化直接使藥效產(chǎn)生差異。

綜上所述，不同干燥方式處理三七會(huì)引起指標(biāo)成分的變化，進(jìn)而導(dǎo)致藥效差異。在主成分分析中80℃熱風(fēng)干燥的三七綜合排名最高，代表其內(nèi)在品質(zhì)較好，但是不同方法炮制的三七其成分也不同，這也就解釋了熱風(fēng)干燥三七在各藥效中不是最佳的原因。因此，在研究新型飲片與傳統(tǒng)飲片差異時(shí)，不能僅將化學(xué)成分作為評(píng)價(jià)飲片品質(zhì)的指標(biāo)，要在成分差異基礎(chǔ)上進(jìn)一步運(yùn)用中醫(yī)藥理論結(jié)合現(xiàn)代工藝技術(shù)探索加工方法影響藥材藥用功效的機(jī)理，可為高品質(zhì)中藥材生產(chǎn)提供依據(jù)。