四唑染色法快速測定北烏頭種子生活力

隋 昕，于 營，魯海坤，于蕓澤，郭 靖，姜業成

（1.中國農業科學院特產研究所，長春 130112；2.吉林省農業科學院資源與環境研究所，長春 130112）

北烏頭（Aconitum kusnezoffii）又稱藍靰鞡花、草烏、雞頭草等，是毛茛科烏頭屬多年生草本植物，塊根為胡蘿卜形或圓錐形，7—9月開花，種子為扁橢圓球形［1］，在中國主要分布于內蒙古、河北、山西以及東北地區［2］。

北烏頭主要以根入藥，性味熱、苦、辛，具有免疫調節、強心、鎮痛消炎、抗腫瘤等作用［3］。由于北烏頭在醫學領域中應用廣泛，需求量不斷增大，但其野生資源有限，生態環境的破壞使其自然繁殖能力減弱，且近年來對北烏頭資源的過度挖采，野生資源所剩無幾［4］。人工種植北烏頭，可以在保護野生種質資源的同時滿足市場的供應需求，主要包括種子繁殖和塊根栽植2種方式。現階段生產上大多以塊根栽植為主，北烏頭種子具有休眠特性，需要3個月時間打破休眠，在適宜條件下萌發，不能快速通過種子發芽率的情況判斷種子質量［5］。利用四唑染色法（TTC）測定北烏頭種子生活力，可快速判斷種子質量，為生產和種子保存提供了參考。

TTC染色法被列進《國際種子檢驗規程》和ISTA，因其操作方便、不受種子特性影響、節省時間等特點，是廣泛使用的一種測定種子活力的方法［6，7］。目前，未見TTC法測定北烏頭種子生活力的系統研究報道。為了提高北烏頭種子的播種效率、保存北烏頭的種質資源以及對北烏頭種子進行深入研究，本研究在正交試驗設計的基礎上，對TTC法測定北烏頭種子生活力的試驗條件進行了優化篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

北烏頭種子采購于黑龍江省伊春市，采購后放入4℃冰箱保存備用。

1.2 TTC染色方法

1.2.1 正交試驗設計運用L9（34）的4因素3水平正交試驗法，設置3個水平以探究TTC染色法測定北烏頭種子活力，分析浸種時間、TTC濃度、染色溫度、染色時間4個因素對種子染色效果的影響，并確定種子染色的最適條件（表1）。

表1 北烏頭種子活力測定正交試驗因素與水平

1.2.2 染色試劑的制備 磷酸緩沖溶液的制備：母液1，稱取107.46 g Na2HPO4·12H2O充分溶解于3 L雙蒸水中；母液2，稱取31.21 g NaH2PO4·2H2O充分溶解于2 L雙蒸水中。取2 440 mL母液1和1 560 mL母液2混合，即為pH 7.0的磷酸緩沖溶液。

不同濃度TTC染色液的制備：分別稱取0.2、0.6、1.0 g的四唑粉劑溶于200 mL的磷酸緩沖液中，即可制備出0.1%、0.3%、0.5%濃度的TTC染色液。隨后將裝有染色液的瓶子用錫紙包裹，避光防止溶液變質，放入4℃冰箱備用。

1.2.3 種子的預濕處理 在盛有等體積雙蒸水的燒杯中放入北烏頭種子，并使種子完全浸沒，在室溫下種子浸泡5、10、15 h，使北烏頭種子吸脹。到達吸脹時間后，瀝水、取出預濕處理的北烏頭種子，用濾紙將種子表面水分吸干，隨機取50粒種子為1個處理組合，重復3次。

1.2.4 種子的染色 將種子縱向對半切開，取其中1/2放入培養皿中，在培養皿中倒入等體積的0.1%、0.3%、0.5%濃度的TTC染色液，完全淹沒種子染色。將恒溫箱調至25、30、35℃，染色時間分別為5、10、15 h。染色完成后倒出染色液，雙蒸水沖洗種子3次后用濾紙吸干表面水分。

1.2.5 觀察染色效果 在40倍解剖鏡下觀察北烏頭種子的染色效果，根據北烏頭種子染色效果判斷種子生活力情況：若種子染成紅色或淡粉色，可判斷為有生活力種子；若種子不變色，可判斷為無生活力種子。

種子生活力=（有生活力的種子數/測定種子總數）×100%

1.3 數據的分析處理

運用SAS分析軟件進行數據的分析處理，利用Excel軟件進行數據整理。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果分析

北烏頭種子經TTC染色法測定的結果見表2。處理組合3（A1B3C3D3）條件下測定北烏頭種子生活力最高，為100.00%；處理組合6（A2B3C1D2）、處理組合8（A3B2C1D3）條件下測定北烏頭種子生活力較高，均為98.00%以上。這3個處理組合條件下測定結果無顯著差異，且染色效果較好，其余處理組合條件下種子生活力測定結果均在95.00%以下，且處理間差異顯著。處理組合1（A1B1C1D1）條件下測定北烏頭種子生活力最低，為37.33%，在該條件下僅有少數的北烏頭種子被染成淡粉色。

2.2 極差分析

對正交試驗結果進行極差分析（表2），TTC法測定北烏頭種子活力時各因素的影響極差值依次為R1=7.78、R2=19.33、R3=3.78、R4=39.78，且R4＞R2＞R1＞R3，即染色時間＞TTC濃度＞浸種時間＞染色溫度。因此，TTC染色法測定北烏頭種子生活力時受染色時間影響最大，其次是TTC濃度、浸種時間，受染色溫度影響最小。

表2 正交試驗測定北烏頭種子活力的結果

通過進一步分析，可依據T值的最大值來判斷TTC染色法測定北烏頭種子活力的最適條件。浸種時間（因素A）中TA2=254.67，是TA1、TA2、TA3中的最大值，則最適宜的浸種時間為12 h；TTC濃度（因素B）中TB3=262.67，是TB1、TB2、TB3中的最大值，TB2=260.66與TB3相差2.01，差距較小，則最適宜的TTC濃度應為0.3%；染色溫度（因素C）中TC2=246.67，是TC1、TC2、TC3中的最大值，則最適宜的染色溫度為30℃；染色時間（因素D）中TD3＝288.00，是TD1、TD2、TD3中的最大值，則最適宜的染色時間為15 h。綜上所述，各因素的最適條件分別為浸種時間12 h、TTC濃度0.3%、染色溫度30℃、染色時間15 h。

2.3 數據的方差分析

用方差分析對正交試驗結果數據進行處理（表3），試驗中各因素對種子染色的影響均有顯著性（P＜0.01），即浸種時間（因素A）、TTC濃度（因素B）、染色溫度（因素C）和染色時間（因素D）對TTC染色法測定北烏頭種子活力時有顯著影響。

表3 方差分析結果

3 結論

3.1 各因素對染色效果的影響

在TTC染色法測定北烏頭種子活力時，4個因素對染色結果的影響均有顯著性，影響大小依次為染色時間＞TTC濃度＞浸種時間＞染色溫度。王志威等［8］研究表明，分析頭花蓼種子TTC染色的最適條件時各因素對染色效果的影響表現為染色溫度＞染色時間＞TTC濃度；雷慧霞等［9］研究表明，分析芍藥種子TTC染色的最適條件時各因素對染色效果的影響表現為浸種時間＞染色時間＞TTC濃度＞染色溫度＞浸種溫度；邢麗偉等［10］在優化TTC染色測定北細辛種子生活力的條件時發現，TTC農度＞染色溫度＞染色時間＞浸種時間。不同種類的種子所含脫氫酶含量不同，遺傳物質和特性也有明顯差異，因此，TTC染色測定不同物種的種子時，各因素對種子染色效果影響大小不同。

3.2 TTC染色法測定北烏頭種子生活力的最適條件

利用正交試驗法測定的不同處理組合中，處理組合3（種子生活力100.00%）、處理組合6（98.67%）、處理組合8（99.33%）3個處理組合染色效果較好且差異不顯著，是TTC染色法測定北烏頭種子生活力的適宜條件。綜合環境污染、試驗成本、試驗效果等問題，在適宜組合中處理組合8為最優組合，即北烏頭種子浸泡18 h后0.3%TTC染色液25℃染色15 h。依據正交試驗的結果，各因素的最適條件分別為浸種時間12 h、TTC濃度0.3%、染色溫度30℃、染色時間15 h。與處理組合8相比，浸泡時間和染色溫度有所不同。處理組合8的浸種時間為18 h，其TA3＝242.00；浸泡時間的最適條件為12 h，其TA2＝254.67，二者相差12.67，相差較大，因此浸泡時間的最適條件為12 h。處理組合8的染色溫度為25℃，其TC1=235.33；染色溫度的最適條件為30℃，其TC2=246.67，二者相差11.34，相差較大，因此染色溫度的最適條件為30℃。綜上所述，種子浸泡12 h后，在30℃下用0.3%TTC染色液避光染色15 h為北烏頭種子TTC染色的最適條件。