牛血紅蛋白β亞基片段衍生抗菌肽的分子設計及其抗菌活性分析

鄧 麗，李 杰，劉保國，杭柏林，3

(1.河南科技學院動物科技學院，新鄉 453003；2.新鄉市農業農村局畜產品質量監測檢驗中心，新鄉 453003；3.揚州大學獸醫學院，教育部禽類預防醫學重點實驗室，江蘇省動物預防醫學重點實驗室，揚州 225009)

抗生素是一把“雙刃劍”，在對人類健康和動物養殖行業作出巨大貢獻的同時也誘導細菌產生耐藥性，增加治療難度，同時其固有的副作用亦危害人與動物的健康[1]。動物養殖行業中抗生素的使用量巨大，且獸用抗生素的不合理使用較為常見，極易導致病原菌耐藥。而耐藥性可通過食物鏈直接或間接地傳遞給人類[2-3]，從而威脅人類健康。規范動物養殖過程中抗生素的合理使用是解決耐藥性傳播的一種重要措施。因此，世界各國逐漸采取不同措施遏制細菌耐藥。其中一個重要措施就是禁止在飼料中添加任何抗生素[4-5]。為保障動物高效健康養殖，可使用抗生素替代物[6]。抗生素替代物有很多種類，其中抗菌肽被認為是抗生素的最佳替代物。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是生物機體先天免疫系統的重要組成部分，具有廣譜抗“菌”(包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲)、免疫調節、抗腫瘤等多種生物學活性[7]。天然抗菌肽存在生物活性低、毒性大、穩定性差、不易獲得、應用成本高等缺陷，限制了其轉化應用[8-10]。隨著生物技術的發展，分子設計和優化策略為開發新型抗菌肽提供了理論基礎[10]。血紅蛋白降解后的某些片段具有抗菌活性，被稱之為血紅蛋白源殺菌肽(hemocidins)[11]。來自牛血紅蛋白的殺菌肽已有許多，但多是通過酶解后分離鑒定或直接從體內或血液中分離鑒定的，還沒有以其氨基酸序列為基礎直接進行分析得到的抗菌肽。兩親性α-螺旋結構被認為是陽離子型抗菌肽發揮抗菌作用的重要基礎。本研究根據抗菌肽的這一結構-功能理論，從牛血紅蛋白β亞基中初步篩選了一個可能為血紅蛋白源殺菌肽的新片段，并以其為基礎，采用氨基酸替換方法設計了3條新多肽，測定其抗菌活性，評價其穩定性和溶血性，以期為研究和開發新型抗菌肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設計多肽的人工合成 本研究設計的多肽均由18個氨基酸殘基構成，由無錫亞肽生物科技有限公司合成，通過高效液相色譜進行純化，純度高于95%。

1.1.2 測試菌株 奇異變形桿菌臨床株[12]和大腸桿菌臨床株[13]均從臨床病豬腸道中分離并鑒定；雞白痢沙門菌CVCC1791和大腸桿菌AE1均由林州市中農穎泰生物肽有限公司惠贈；大腸桿菌CVCC1568、豬霍亂沙門菌CVCC3776、雞白痢沙門菌CVCC533、綠膿假單胞菌CVCC2087和金黃色葡萄球菌CVCC6538均購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌CMCC44103購自中國醫學細菌保藏管理中心；大腸桿菌CVCC8099、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、白色念珠菌ATCC 10231均由河南科技學院動物檢疫實驗室惠贈。

1.1.3 主要試劑及儀器 胰酪大豆胨液體(TSB)培養基購自青島海博生物技術有限公司；硫酸銅和氯化鈣均購自天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)購自北京索萊寶生物科技有限公司；濃鹽酸、氫氧化鈉、三氯化鐵、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂均購自國藥集團化學試劑有限公司。

pH計(型號：PHS-3C)購自上海儀電科學儀器股份有限公司；酶標分析儀(型號：INFINITEPRO)購自Tecan公司；恒溫培養箱(型號：GNP-9270)購自上海精宏實驗設備有限公司；高壓蒸汽滅菌器(型號：LDZX-30KAS)購自上海申安醫療器械廠；純水儀(型號：ZYTEST-I-10T/20T)購自四川卓越水處理設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多肽的設計及其生物信息學分析 將牛血紅蛋白β亞基的氨基酸序列輸入HeliQuest在線工具(https:∥heliquest.ipmc.cnrs.fr/)，運行后得到許多18個氨基酸殘基構成的多肽及其螺旋輪、帶電荷數、總疏水率和疏水力矩等相關信息，根據“兩親性、帶正電荷和α-螺旋”的特征進行多肽篩選；利用APD3數據庫(https:∥aps.unmc.edu/)對設計多肽與庫內收集的抗菌肽進行相似性分析；利用ProtParam在線工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析多肽的理化性質；利用SOPMA在線工具(http:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析多肽二級結構；利用PEP-FOLD3在線工具(https:∥mobyle.rpbs.univ-paris-diderot.fr/cgi-bin/portal.py#forms::PEP-FOLD3)對多肽進行3D作圖；利用HeliQuest在線工具繪制改造多肽的螺旋輪模型，計算其疏水力矩。

1.2.2 抑菌活性分析 通過測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)來反映多肽的抑菌活性。當MIC≤400 μg/mL時，認為多肽有抑菌活性。將不同菌株用TSB培養基于37 ℃過夜培養，轉接種后繼續培養3～5 h，10 000 r/min離心5 min，用滅菌PBS(pH 7.2)洗滌3次，用TBS培養基將細菌濃度調整至2×106CFU/mL，取菌液加入96孔板中，100 μL/孔。同時用TSB培養基倍比稀釋設計多肽，取不同稀釋度的多肽加入96孔板的對應孔中，100 μL/孔。混勻后，置于37 ℃培養箱中培養24 h。以沒有菌體生長的最高稀釋度的多肽濃度為抑制該菌生長的MIC。肉眼觀察孔中溶液，如渾濁，則有菌體生長；如澄清，則沒有菌體生長。

1.2.3 穩定性分析 在TSB培養基中加入瓊脂糖，使其濃度為2%，滅菌，冷卻至50 ℃左右時，加入按1.2.2中配制的大腸桿菌CVCC8099菌液，使菌液終濃度為1×106CFU/mL，混勻，立即倒平板，凝固，打孔，封底，備用。將篩選出的有抑菌活性的抗菌肽進行不同處理，加入平板的相應孔中，20 μL/孔，靜置3 h，置于37 ℃培養箱中培養24 h，取出，用直尺測量抑菌圈直徑。

1.2.3.1 熱穩定性分析 將抗菌肽溶液分別置于0、20、40、60、80和100 ℃處理15 min，測定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.3.2 鹽離子穩定性分析 將抗菌肽置于不同鹽離子溶液(1×PBS、150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L CaCl2、4 μmol/L FeCl3、25 μmol/L CuSO4)中處理15 min，然后測定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.3.3 酸堿穩定性分析 將抗菌肽溶液置于pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的TSB培養基中處理15 min，測定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.3.4 反復凍融穩定性分析 將抗菌肽溶液反復凍融4、6、8、10、12、14次，測定抗菌肽的抗菌活性。

1.2.4 溶血性分析 無菌采集健康大耳白母兔(3月齡左右，約1.5 kg，購自新鄉市洪門鎮菜市場)血液，用3.8%檸檬酸鈉溶液抗凝，3 000 r/min離心10 min，沉淀用滅菌PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌3次，配制成1%兔紅細胞懸液，加入滅菌離心管中，100 μL/管。將抗菌肽用滅菌PBS(pH 7.2)進行倍比稀釋，不同濃度的抗菌肽溶液加入相應離心管中，100 μL/管。將離心管置于37 ℃作用1 h，3 000 r/min離心5 min，取上層液體加入相應的96孔板中，用酶標分析儀于波長540 nm處測定各孔溶液的吸光度值(D540 nm值)。用1% Triton X-100作為陽性對照，用PBS緩沖液作為陰性對照。

溶血率(%)=(D540 nm肽-D540 nm陰性對照)/(D540 nm陽性對照-D540 nm陰性對照)×100%

2 結 果

2.1 多肽的一級結構

在牛血紅蛋白β亞基中篩選了1條多肽，然后采用氨基酸替換方法新設計了3條多肽。設計多肽的氨基酸序列見表1。其中YKK-18是牛血紅蛋白β亞基中第64-81位氨基酸殘基構成的多肽，有18個氨基酸殘基，而DLK-3、LJ-1和LJ-2是替換了YKK-18序列中部分氨基酸后得到的多肽，分別替換了8、7和15個氨基酸。

表1 設計多肽的一級結構

2.2 多肽的相似性分析

將設計的4條多肽與APD3數據庫中收集的抗菌肽進行氨基酸序列相似性比對，記錄最高的相似性，結果見表2。由表2可知，4條多肽與APD3數據庫中已收錄抗菌肽的氨基酸序列相似性均不超過50%。表明設計的4條多肽均是新的多肽。

表2 設計多肽與APD3數據庫中抗菌肽的相似性比對

2.3 多肽的理化特性

通過在線工具對設計的4條多肽進行理化特性分析，結果見表3。由表3可知，4條多肽的等電點均>7；4條多肽均帶正電荷，其中YKK-18所帶電荷數較少，DLK-3所帶電荷數較多，而LJ-1和LJ-2所帶電荷數中等；總平均親水性(GRAVY)值均<0，表明4條多肽均為親水性多肽，推測溶于水；YKK-18為穩定的多肽，其他3條多肽為不穩定多肽；LJ-2的熱穩定性最高，其次是DLK-3和LJ-1，YKK-18較差；YKK-18的總疏水率和疏水力矩均低于其他3條多肽，DLK-3、LJ-1和LJ-2的疏水力矩值依次降低，表明DLK-3、LJ-1和LJ-2的兩親性程度逐漸降低。

表3 設計多肽的理化性質

2.4 設計多肽的二級結構、3D模型及螺旋輪結構

在線工具分析設計多肽的二級結構預測結果見表4。由表4可知，YKK-18有2種二級結構類型，即α-螺旋和β-轉角，且螺旋度較高；而改后的3條多肽(DLK-3、LJ-1和LJ-2)只有1種二級結構類型，即α-螺旋。

表4 設計多肽的二級結構預測結果

對設計多肽進行3D模型模擬，結果見圖1。由圖1可知，YKK-18為全α-螺旋結構，而DLK-3、LJ-1的中間為α-螺旋結構，DLK-3的氮端和LJ-1的羧基端為延伸鏈結構，LJ-2的兩端為α-螺旋結構，中間有個無規則卷曲結構，這與二級結構預測結果有差異。但3D模型均表明4條多肽中均存在高含量的α-螺旋結構。

圖1 設計多肽的3D模型

設計多肽的螺旋輪模型見圖2。由圖2可知，4條設計多肽均呈兩親性結構，其中，DLK-3的兩親性最好，其次依次為LJ-1和LJ-2，而YKK-18的兩親性較差。

①黃色，非極性疏水性氨基酸殘基；藍色，極性帶正電荷氨基酸殘基；淡紅色，極性不帶電荷中性酰胺類氨基酸殘基；紫色，極性不帶電荷中性含羥基類氨基酸殘基；灰色，極性不帶電荷疏水性氨基酸殘基；淡藍色，極性不帶電荷堿性氨基酸；紅色，極性帶負電荷酸性氨基酸。②數字表示氨基酸殘基的位置；箭頭長短表示疏水力矩大小，疏水力矩指示多肽的兩親性程度

2.5 多肽的抑菌活性

通過倍比稀釋法測定了4條設計多肽對不同菌株的MIC以反映設計多肽的抑菌活性，結果見表5。由表5可知，YKK-18對測試的13種菌株均沒有抑菌活性，但DLK-3、LJ-1和LJ-2對這13種測試菌株中的12種(除了奇異變形桿菌)均具有抑菌活性，其中DLK-3的抑菌活性比LJ-1和LJ-2強，LJ-1和LJ-2對革蘭陰性菌的抑菌活性強于對革蘭陽性菌的抑菌活性，總體上LJ-2的抑菌活性低于DLK-3和LJ-1。表明設計的3條多肽DLK-18、LJ-1和LJ-2是具有不同抑菌活性的抗菌肽。

表5 設計多肽對部分菌株的最小抑菌濃度

2.6 抗菌肽的抑菌穩定性

2.6.1 抗菌肽熱穩定性分析 由圖3可知，隨著溫度的升高，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2的抑菌活性逐漸降低，但仍有較高的抑菌活性，表明這3條多肽的抑菌活性具有熱穩定性。

圖3 溫度對設計抗菌肽抑菌活性的影響

2.6.2 抗菌肽鹽離子穩定性 由圖4可知，在7種不同的鹽溶液(生理性濃度)中，3條抗菌肽仍有抑菌活性，表明3條抗菌肽的抑菌活性具有鹽離子穩定性。

1,pH 7.2 PBS；2，150 mmol/L NaCl，3，5 mmol/L KCl；4，1 mmol/L MgCl2；5，5 mmol/L CaCl2；6，4 μmol/L FeCl3；7，25 μmol/L CuSO4

2.6.3 抗菌肽酸堿穩定性 由圖5可知，在pH 4.0～6.0或pH 8.0～10.0時，3條抗菌肽的抑菌活性比pH 7.0時有所降低，但抑菌活性仍較高，表明3條抗菌肽的抑菌活性具有酸堿穩定性。

圖5 pH對設計抗菌肽抑菌活性的影響

2.6.4 抗菌肽反復凍融穩定性 由圖6可知，隨著凍融次數的增加，3條抗菌肽的抑菌活性逐漸降低，但仍有較高抑菌活性，表明3條抗菌肽的抑菌活性具有反復凍融的穩定性。

圖6 反復凍融對設計抗菌肽抑菌活性的影響

2.7 抗菌肽的溶血性

由圖7可知，抗菌肽DLK-3在25 μg/mL時的溶血率已超過5%，而抗菌肽LJ-1和LJ-2在200 μg/mL的高濃度時溶血率仍低于5%，表明抗菌肽DLK-3有較高的溶血性，而抗菌肽LJ-1和LJ-2有較低的溶血性。

圖7 設計抗菌肽的溶血性

3 討 論

抗菌肽作為抗生素替代物被廣泛開發和應用，但其也存在一些缺點[14]。因此，對天然抗菌肽進行改造或分子設計以獲得性能更佳的抗菌肽成為研究熱點。抗菌肽分子設計中常以天然抗菌肽序列為模板進行氨基酸替換及肽段截短、拼接或雜合[14-15]。本研究以動物天然蛋白序列為基礎，根據抗菌肽的構效關系篩選潛在抗菌肽序列，并以此為基礎，通過氨基酸替換，設計新的多肽序列并驗證其抗菌活性，最終獲得2條性能較佳的抗菌肽。

生物機體蛋白的一級結構是由氨基酸殘基經排列組合后形成的長短不一的多肽，其中某些肽段含有抗菌肽構成的3個要素，即α-螺旋、帶正電荷和兩親性結構。本研究從牛血紅蛋白β亞基中初篩潛在抗菌肽時即以上述3個要素為依據，同時為方便應用，以親水性為參考，篩選了1條多肽YKK-18。本研究設計的多肽的二級結構預測結果與3D模型預測結果有差異，可能與不同在線工具的算法有關。多肽成為抗菌肽的首要條件是有抗菌活性，而多肽YKK-18沒有抗菌活性。為此，以YKK-18的氨基酸序列為基礎，通過氨基酸替換，改變多項性能參數(如增加正電荷數，提高兩親性程度、螺旋含量、疏水率等)，重新設計了3條多肽，經驗證，3條多肽對不同測試菌株有不同程度的抗菌活性。

抗菌肽抗菌活性受自身電荷數、疏水性、兩親性、二級結構的影響[10]。目前，雖然存在不帶電荷或帶負電荷的抗菌肽，但絕大多數抗菌肽均帶有不同數量的正電荷[16]。兩親性對抗菌肽破壞細菌細胞膜非常重要[17]，是設計抗菌肽時亦要考慮的因素。兩親性程度高的抗菌肽具有較好的抗菌活性。絕大多數抗菌肽具有螺旋結構，且抗菌譜廣[18-19]。增加多肽的疏水性亦能提高抗菌肽的抗菌活性[20]。本研究設計的3條新多肽所帶正電荷數、兩親性程度、螺旋含量、疏水率等均高于模板肽，是新設計多肽具有抗菌活性的重要基礎。增加多肽的電荷數是提高抗菌肽抗菌活性的重要手段[18]。本研究中多肽LJ-1和LJ-2均帶5個正電荷，多肽DLK-3帶8個正電荷，這亦可能是多肽DLK-3的總體抗菌活性優于多肽LJ-1和LJ-2的原因。

溶血性是影響抗菌肽應用的一個重要因素[21]。一般認為，影響抗菌肽溶血性的因素主要包括帶正電荷數目、疏水性、兩親性程度、二級結構等。其中，數量較多的正電荷會提高抗菌肽的溶血性[22]。因此，在抗菌肽設計過程中，在保證較好抗菌活性的基礎上，降低多肽的正電荷數，改變多肽的其他理化特征，可降低溶血率[21]。本研究結果顯示，多肽DLK-3帶較多的正電荷，其溶血率也較高，而多肽LJ-1和LJ-2所帶正電荷數少于DLK-3，溶血率也低。以多肽DLK-3為模板，可繼續進行新抗菌肽的分子設計，以期獲得性能更佳的抗菌肽。

抗菌肽應用于生物機體時受多種因素作用，進而影響使用效果。影響抗菌肽使用效果的理化因素主要包括溫度、酸堿環境、鹽離子等[14]。因此，測定抗菌肽在這些理化因素作用下的穩定性可評價抗菌肽的應用潛力。熱穩定性是影響抗菌肽保存和使用的重要因素。某些抗菌肽抗菌活性在受熱和反復凍融后會下降，如絲光綠蠅抗菌肽[23]、海南沼洼皮膚抗菌肽[24]、BSN-37[25]等，但仍保留有抗菌活性。經分析，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2經高溫(100 ℃)處理及反復凍融14次后抗菌活性雖仍較高但也有所下降。這提示，在使用抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2時應低溫保存，同時要避免多次反復凍融。pH和鹽離子是抗菌肽在生物體內應用時的重要影響因素[26]。在生物體生理性pH與鹽離子條件下有較好的抗菌活性，是抗菌肽開發應用的前提。本研究結果顯示，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2在生理性pH與鹽離子條件下仍能保留有較高的抗菌活性，值得繼續深入開發。

4 結 論

本研究從牛血紅蛋白β亞基篩選的1條多肽沒有抗菌活性，但以其序列為模板設計的3條新肽(DLK-3、LJ-1和LJ-2)對革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌、沙門菌、銅綠假單胞菌)和真菌(白色念珠菌)均有抗菌活性，抗菌肽DLK-3、LJ-1和LJ-2為親水性的陽離子型α-螺旋多肽，具有較好的熱穩定性、酸堿穩定性、鹽離子穩定性、反復凍融穩定性，抗菌肽DLK-3的溶血性較高，而抗菌肽LJ-1和LJ-2的溶血性極低。抗菌肽LJ-1和LJ-2具有作為抗生素替代物的極高潛力，值得進行深入研究。