湖羊胚胎和精液超低溫保存效果的評價

劉 剛，朱芳賢，章曉煒，顧 峰，劉莉君，蘇 銳，孟 飛，許海濤，孫飛舟

(1.全國畜牧總站，北京 100193；2.浙江省畜牧技術推廣與種畜禽監測總站，杭州 310021；3.蘇州太湖東山湖羊產業發展有限公司，蘇州 215107)

近年來，超低溫冷凍保存技術對畜禽遺傳資源保種的貢獻越來越大，在畜禽遺傳資源保護中發揮了重要作用[1-6]：①超低溫冷凍保存技術保種可以規避風險，大量回收供體的配子和胚胎，提高安全性，可以克服活體保種中疫病、自然災害 (干旱、水災、戰爭爆發等)等因素造成的保種困難；②實現了遺傳材料的超低溫保存，可長時間完整保存畜禽的遺傳信息，防止漂變。目前配子和胚胎冷凍保存的年限為200年以上，尤其是活體保種過程中群體有效含量降低到一定水平后，受近交和遺傳漂變等因素的制約，活體保種很難成功；③提高了保種效率，省時省力，節省資金，快速搶救性地保護了更多的瀕危畜禽遺傳資源。1992年，受世界銀行中國農業支持服務項目資助，中國開始利用超低溫冷凍技術保存畜禽的精液、胚胎和體細胞等遺傳材料。截至2021年底，國家家畜基因庫中畜禽遺傳資源冷凍精液、冷凍胚胎、體細胞等遺傳材料保存總量達到120萬余份，躍居世界首位。湖羊是中國特有的羔皮用綿羊品種，也是世界著名的多羔綿羊品種，具有性成熟早、繁殖力高、宜舍飼等優良特性[7]。據國家畜禽遺傳資源品種名錄(2021版)統計，中國綿羊有地方品種44個、培育品種33個、引入品種13個。為了檢驗長期保存的湖羊冷凍胚胎和冷凍精液的制作和保存質量，評價超低溫冷凍保存技術保種的效果，同時為保種場擴充血緣，本試驗對國家家畜基因庫長期保存的湖羊冷凍胚胎和冷凍精液進行復蘇利用，對后代開展性能測定，驗證其遺傳材料長期超低溫保存效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 孕酮陰道栓(CIDR)，新西蘭DEC國際有限公司生產，1.9 g/支，批號：2017.11.20；氯前列烯醇(PG)，上海市計劃生育科學研究所生產，0.2 mg/2 mL/支，批號：2017.06.13；孕馬血清促性腺激素(PMSG)，寧波三生藥業有限公司生產，1 000萬IU/支，批號：2016.12.15；促黃體素釋放激素A3(促排卵3號)，寧波三生藥業有限公司生產，20 μg/支，批號：2017.07.12；精液稀釋劑，法國卡蘇公司生產，批號：2018.02.23。

1.1.2 試驗用冷凍胚胎和冷凍精液 湖羊種羊群體的冷凍胚胎和冷凍精液在浙江余杭湖羊場(現國家湖羊保種場)和浙江吳興種羊場進行制作，并保存于國家家畜基因庫。本次研究使用試驗材料為1998年制作保存20年的冷凍胚胎36枚，1988年制作保存30年的安瓿冷凍精液27劑(30年冷凍精液組)，1998年制作保存20年的0.25 mL細管冷凍精液75劑(20年冷凍精液組)。

1.1.3 試驗動物 為了更好地與目前的湖羊對照，試驗選擇在湖羊原產地國家級保種場和保護區及省級保種場進行，胚胎移植受體羊、冷凍精液配種受體羊、鮮精配種和本交配種受體羊都選擇純種湖羊，其胎次在2～4胎、遺傳背景一致、膘情中等、健康、繁殖性能好(母性好)的公羊和空懷母羊。2018年3月初開始受體羊選擇并單獨組群，最終選擇了18只公羊和160只母羊，提供相同的飼養管理方式。

1.2 方法

1.2.1 受體羊同期發情處理 胚胎移植受體采用CIDR+PG+PMSG同期化處理，放栓日為第1天，放栓后第12天撤栓，同時注射PG 1支、PMSG 300 IU，撤栓后24 h觀察發情(用公羊試情)，發情后注射促排卵3號 1支。冷凍精液人工授精和本交試驗羊采用CIDR+PG同期化處理。

1.2.2 胚胎移植

1.2.2.1 冷凍胚胎解凍及鑒定 ①冷凍胚胎解凍及鑒定：從液氮罐中取出裝有胚胎的細管，室溫下放置10 s后投入32～35 ℃水浴中2 min。用消毒紙巾擦干細管，剪去封口端，將胚胎推入培養皿中，然后將胚胎依次移入分別含有6%、3%、0甘油的0.1 mol/L蔗糖的PBS解凍液中，分別停留5 min，最后用保存液洗3次，鏡檢。胚胎質量依據《牛羊胚胎質量檢測技術規程(NY/T 1674—2008)》進行鑒定，根據胚胎內細胞團的卵裂球輪廓清晰度、明暗度，細胞密度及卵裂均勻度等形態結構判斷級別。發育正常的胚胎，其卵裂球輪廓清晰，明暗度適中，細胞密度大，卵裂均勻，細胞變性率不超過10%，劃分為A級胚胎；胚齡與發育期基本吻合，輪廓清晰，明暗適中或稍暗或稍淡，細胞密度較小或小型卵裂球過多，細胞變性率為10%～20%，劃分為B級胚胎；輪廓不清晰，色澤過暗或者過淡，細胞密度小，細胞變性率為30%～40%，劃分為C級胚胎；退化胚、變性胚劃分為D級胚胎。

1.2.2.2 胚胎移植 參考《羊胚胎移植技術規程(NY/T 1571—2007)》進行胚胎移植，每個受體移植1～3枚胚胎。

1.2.3 冷凍精液解凍及人工授精

1.2.3.1 試驗分組 試驗分為30年冷凍精液組、20年冷凍精液組、0年冷凍精液組、鮮精組和本交組。其中鮮精組精液采集于國家湖羊保種場的12只湖羊公羊，采用相差顯微鏡目測，精子活力達到0.6以上進行后續試驗。0年冷凍精液組的精液采集于國家級湖羊湖羊保護區(江蘇)的6只公羊，供體公羊均為隨機選擇，其繁殖性能正常，0年冷凍精液制成后存放于液氮中保存備用，使用時解凍后用相差顯微鏡目測，其解凍后精子活力在40%以上進行后續試驗。本交組公羊來源于國家湖羊保護區(江蘇)，隨機選擇10只采取本交方法配10只試驗母羊，用于后代生長發育和后代繁殖性能等的比較。

1.2.3.2 冷凍精液解凍及精液質量鑒定 30年安瓿冷凍精液解凍方法為在60 ℃溫水中快速解凍14 s，20年和0年的0.25 mL細管冷凍精液解凍方法為在38 ℃溫水中解凍15 s。冷凍精液質量依據《山羊冷凍精液(GB 20557—2006)》對精液活力、密度和畸形率等指標進行檢測。

1.2.3.3 人工授精 將不同組的精液稀釋到每毫升精液中直線向前運動精子數在3 000萬個左右，采用內窺鏡子宮角輸精手術進行人工授精，每只羊輸入0.7 mL，含2 400萬個直線運動精子。

1.2.4 胚胎移植羊和冷凍精液后代羔皮性能評定 羔皮性能以一級羔皮率指標評價，根據《小湖羊皮(GB/T 14629.1—2018)》和《湖羊(GB 4631—2006)》標準對試驗羊及后代羊的花紋類型、花紋面積、花紋寬度、毛長、花紋緊密度、羔皮等級進行鑒定并給予等級評定。

1.2.5 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長發育測定 根據《綿、山羊生產性能測定的技術規范(NY/T 1236-2006)》標準對胚胎移植羊和冷凍精液后代的初生重、斷奶重、6月齡體重和體尺等指標進行測定。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行單因素方差分析,用Duncan氏法進行組間多重比較，試驗結果以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 胚胎保存效果

2.1.1 復蘇胚胎形態鑒定 本試驗共解凍胚胎36枚，其中，A級胚胎22枚，B級胚胎7枚，C級胚胎5枚，D級胚胎2枚。按C級以上為有效胚胎計，冷凍胚胎復蘇利用率達到94.44%(34/36)，A級胚胎率達到61.11%(22/36)。

2.1.2 胚胎移植效果及后代羔皮性能 從2018年8月29日開始胚胎移植試驗，對19只符合移植的受體母羊進行移植，13只懷孕分娩，受胎率為68.42%；共移植胚胎34枚，出生17只羔羊，沒有畸形個體，胚胎復蘇移植產羔率為50.00%，成活羔羊16只，羔羊成活率為94%，一級羔皮率為31.25%，經過鑒定，其體型外貌符合純種湖羊特征，并保持了當年湖羊的羔皮特性。

2.2 精液保存效果

2.2.1 精液質量檢測 30年冷凍精液組、20年冷凍精液組、0年冷凍精液組、鮮精組精液檢測結果見表1。30年和20年冷凍精液組精子活力均高于30%，且30年冷凍精液組精子活力高于20年組。

表1 精液質量檢測結果

2.2.2 冷凍精液配種后代性能 由表2可知，試驗中保存30年的冷凍精液受胎率為58.57%，羔羊一級羔皮率為42.03%，毛色更加潔白、波浪形花紋更加明顯，再現了30年前湖羊羔皮性能的典型特征；保存20年冷凍精液受胎率為53.66%，羔羊一級羔皮率為23.81%，二者后代均沒有畸形個體；保存30年冷凍精液受胎率均極顯著高于20年和0年冷凍精液組(P<0.01)，極顯著低于鮮精組和本交組(P<0.01)。保存30年冷凍精液羔羊一級羔皮率極顯著高于其他組(P<0.01)。

表2 試驗羊受胎產羔情況及后代羔皮性能

2.3 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長發育和繁殖情況

2.3.1 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長發育情況 由表3可知，胚胎移植羊初生重、斷奶重、6月齡體重、體高和胸圍等指標均高于其他組(P<0.05)，30年冷凍精液和20年冷凍精液組后代初生重、斷奶重、6月齡體尺與0年冷凍精液、鮮精組和本交組差異均不顯著(P>0.05)。本交組后代初生重、斷奶重、6月齡體重、6月齡體高和6月齡胸圍等指標低于胚胎復蘇羊、30年冷凍精液和20年冷凍精液組(P<0.05)。

表3 胚胎移植羊和冷凍精液后代生長發育情況

2.3.2 胚胎移植羊和冷凍精液后代繁殖情況 由表4可知，試驗出生的9只胚胎移植羊母羊100%受胎產羔，其后代平均產羔數和繁殖成活率都高于鮮精組和本交組(P<0.05)，一級羔皮率明顯高于鮮精組和本交組(P<0.01)，也高于30年和20年冷凍精液組(P<0.05)。30年和20年冷凍精液組后代都能正常受胎產羔，受胎率高于鮮精組和本交組；30年和20年冷凍精液組平均產羔數和繁殖成活率低于鮮精組和本交組，但差異均不顯著(P>0.05)，30年冷凍精液組的一級羔皮率高于20年冷凍精液組(P<0.05)，30年冷凍精液組的一級羔皮率高于鮮精組及本交組(P<0.01)，20年冷凍精液組也高于鮮精組和本交組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 胚胎保存效果分析

胚胎超低溫冷凍保存是在極低的溫度(—196 ℃)下保存動物胚胎，處于超低溫下的胚胎新陳代謝幾乎完全停止，可以達到長期保存的目的。學者們先后在牛[8]、綿羊[9]、山羊[10]、馬[11]、豬[12]等畜種進行了冷凍保存試驗，并得到移植后代。朱士恩等[13]將小鼠擴張囊胚分別在液氮中冷凍保存1 h、1年和2年，解凍后囊胚形態恢復率分別為100%、98%和98%。本試驗中冷凍胚胎復蘇利用率達到91.67%，A級胚胎率達到33.3%，表明胚胎長期保存后也有好的恢復率。胚胎冷凍保存10年以上進行移植在中國還未有報道，Whittingham等[14]開展了小鼠胚胎的長期冷凍試驗，將小鼠胚胎的冷凍時間延長到8個月，并對胚胎進行異地移植，獲得成功。王光亞等[15]對奶山羊的胚胎進行長期冷凍保存，將冷凍保存的時間延長到819 d，成功獲得成活羔羊。尹海科等[16]報道冷凍8年的布爾山羊胚胎移植成功，胚胎復蘇移植產羔率為41%，以上報道表明胚胎冷凍保存后可以復蘇。胡振尉等[17]在1985年制作湖羊保種胚胎時解凍34枚胚胎，有24枚可以利用(占70.58%)，其中10枚胚胎用外科手術法移植給3只受體母羊，2頭懷孕，受胎率66.6%，產活羔3只，胚胎復蘇移植產羔率33.3%，低于本試驗胚胎復蘇移植產羔率50.00%，因此本試驗也表明胚胎長期冷凍保存后可以復蘇，且隨著繁殖技術提高也可以獲得好的冷凍胚胎復蘇移植效果。

3.2 冷凍精液保存效果分析

本試驗結果顯示，保存30年和20年的冷凍精液，解凍后活力均在30%以上，與制作時(1988年和1998年)的活力相當。冷凍精液質量檢測結果中，20年冷凍精液活力低于30年冷凍精液，可能因為30年冷凍精液是以安瓿為載體，制作時(1988年)技術成熟，而20年冷凍精液是以細管為載體，制作時(1998年)是才開始研究推廣的技術。配種試驗結果表明，保存30年和20年冷凍精液受胎率都達到了制作年代的受胎率。胡振尉等[17]1985年開展了湖羊冷凍精液的輸精試驗，其情期受胎率在36.5%～75.0%，其中保存30年冷凍精液比20年受胎率高，與保存30年的活力高于20年的相關；保存30年和20年冷凍精液的后代成活率與鮮精組和本交組的后代成活率基本一致。以上結果說明冷凍精液長期保存后質量和配種效果變化不明顯。

3.3 胚胎移植羊和冷凍精液后代遺傳性能和適應性

試驗結果顯示，30年冷凍精液后代一級羔皮率高于20年胚胎移植羊和20年冷凍精液后代以及鮮精組和本交組；胚胎移植羊一級羔皮率是31.25%，高于2019年湖羊保種場的26.05%(242/929)，與1989年制作胚胎時保種場的湖羊一級羔皮率(34.08%)相當(數據來源于余杭保種場1989年測定數據)，試驗結果充分說明胚胎移植羊和冷凍精液后代保持了當年湖羊羔皮特性。本試驗羔皮等級結果符合湖羊養殖發展歷史，即從20世紀90年代后期開始，由于市場需求，湖羊選育目標以肉用為主，羔皮性能不再是主要指標，一級羔皮率有所下降。后代生產性能測定結果顯示，胚胎移植羊初生重、斷奶重、6月齡體重等指標均高于其他組，可能是由于母羊產羔數少，羔羊得到更多的母乳。冷凍精液后代各項指標與鮮精組及本交組差異不顯著，胚胎移植羊100%受胎產羔，30年和20年冷凍精液后代都能正常受胎產羔，受胎率與鮮精組及本交組差異不顯著，以上結果說明胚胎移植羊和冷凍精液后代可以適應當前的生存環境，并能正常生長和繁殖。下一步將利用分子生物學方法[6,18-21]對后代羊進行深入分析。

4 結 論

本研究對保存20年的湖羊冷凍胚胎、20年和30年的冷凍精液進行復蘇，并連續跟蹤近2年，對胚胎移植羊和冷凍精液后代生長、繁殖性能進行測定，其冷凍胚胎復蘇率超過94%，冷凍精液復蘇后活力均超過30%；胚胎移植羊和冷凍精液后代體型外貌鑒定均符合純種湖羊特征，保持了湖羊原來的外貌特征，尤其是保持了當年的羔皮性能；其后代生長發育及繁殖性能與現在的湖羊基本保持一致。研究充分證實了利用超低溫冷凍技術長期保存湖羊冷凍精液和冷凍胚胎的方法是可行的，這是畜禽保種方式的重大突破，對地方品種保種具有重要意義。

致 謝：江蘇省畜牧總站張志峰，浙江省畜牧技術推廣與種畜禽監測總站馬敏彪和劉雅麗，浙江華麗牧業有限公司白麗華和白慧琴，長興永盛牧業有限公司胡志宏，天津市畜牧研究所張效生等參與了大量基礎性工作。