甘草酸對脂多糖應(yīng)激黃羽肉仔雞免疫性能的影響

高嘉豪，喬彥杰，連科迅，王蒙蒙，谷新利，邵永斌

(石河子大學動物科技學院，石河子 832003)

在畜禽生產(chǎn)中，免疫應(yīng)激常導致畜禽機體某些組織器官的結(jié)構(gòu)功能發(fā)生病理性變化，造成生長性能和產(chǎn)品品質(zhì)下降，死亡率升高[1]。陳理盾等[2]研究表明，實際生產(chǎn)中單是疫苗注射引起的免疫應(yīng)激就能顯著影響雛雞體重，最高時達20%，最低時也有2%。因此在臨床生產(chǎn)中，獸醫(yī)針對畜禽應(yīng)激，常用到一些抗生素進行處理，但容易使機體產(chǎn)生耐藥性，并產(chǎn)生藥物殘留等諸多弊端，而中草藥添加劑具有促進畜禽生長發(fā)育﹑調(diào)節(jié)免疫力等作用[3-4]，因此研制安全有效、天然無抗的中草藥添加劑代替抗生素已成為畜牧行業(yè)減抗乃至無抗養(yǎng)殖的解決途徑之一[5]。

甘草屬于豆科植物甘草屬，是中醫(yī)藥及中獸醫(yī)中廣泛應(yīng)用且具有悠久歷史的中草藥，用藥部位主要是根莖部，具有極為豐富的生物學作用。甘草酸(glycyrrhizic acid，GA)是從甘草中分離出的三萜皂苷類活性物質(zhì)，是甘草提取物中含量最多的化合物，同時也是甘草質(zhì)量評定的最主要指標之一，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等藥理特性[6-7]。陳璟怡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加0.1%甘草提取物可對肉仔雞的生長起到促進作用，同時可提高其免疫器官指數(shù)與疫苗免疫后的抗體效價。邵琦等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞飲水中添加50 mg/L甘草霜(粉狀甘草粗提物)可增強肉仔雞免疫作用和抗氧化功能。但是GA作為抗生素替代品用于改善黃羽肉仔雞免疫性能的研究較少。

本研究使用GA作為飼料添加劑，通過建立黃羽肉仔雞脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)免疫應(yīng)激模型并測定血清免疫指標，評價GA免疫調(diào)節(jié)作用，以期為GA在黃羽肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用或深入研究提供科學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

GA(98%)和黃芪多糖(70%)，均購自上海吉至生化科技有限責任公司；LPS(EscherichiacoliO55:B5)購自Sigma公司；雞免疫球蛋白A(IgA) ELISA試劑盒(批號：202107)、雞免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒(批號：202107)、雞免疫球蛋白M(IgM)ELISA試劑盒(批號：202107)、雞CD4分子ELISA試劑盒(批號：202107)和雞CD8分子ELISA試劑盒(批號：202107)均購自江蘇晶美生物科技有限公司。超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；Sartorius BS210S電子分析天平購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ST16 ST16R高速冷凍離心機購自Thermo公司；多功能酶標儀Biotek SynergeyTM2購自伯騰儀器有限公司；WP25AB恒溫培養(yǎng)箱購自上海滬粵明科學儀器公司。

1.2 試驗設(shè)計與飼糧標準

300只1日齡體重相近的健康快大型黃羽肉仔雞購自新疆泰昆集團股份有限公司石河子市某孵化廠；基礎(chǔ)飼糧為全價配合飼料(烏魯木齊正大畜牧有限公司)，基礎(chǔ)飼糧組成與營養(yǎng)水平見表1。肉仔雞適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為6組，即空白對照組、LPS組、黃芪多糖組(APS)、高劑量GA組(GAH)、中劑量GA組(GAM)和低劑量GA組(GAL)。空白對照組于14、16、18和20日齡10：00～11：00腹腔注射0.9%無菌生理鹽水2 mL，其余組注射等體積LPS溶液(1.5 mg/kg BW)建立體內(nèi)免疫應(yīng)激模型。空白對照組和LPS組飼喂基礎(chǔ)飼糧，APS組、GAH組、GAM組和GAL組于應(yīng)激模型建立階段及前后3天(即11～23 d)分別在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg APS和120、100、80 mg/kg GA。試驗期49 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成與營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

續(xù)表

1.3 飼養(yǎng)管理

肉仔雞采用室內(nèi)網(wǎng)上平養(yǎng)方式，雞舍用具于入雞前3周徹底打掃沖洗，采用固體甲醛熏蒸消毒1周，通風。入雞前24 h內(nèi)使用控制器將雞舍溫度保持在32～35 ℃，入雞后溫度不變且24 h光照維持1周，之后溫度每周下降2～3 ℃，最后控制在20～22 ℃，每天光照23 h。所有試驗雞用常規(guī)免疫程序免疫，自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理方式均一致。

1.4 指標測定

分別于試驗雞第21、28、35、42、49日齡，每組隨機選取10只雞，每個重復2只，翅靜脈采血5 mL/只，采集的血液在常溫下傾斜靜置2 h，再3 000 r/min離心10 min，收集血清，—20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｗ詈蟀凑誆LISA試劑盒說明書測定免疫細胞CD4、CD8和免疫活性物質(zhì)IgA、IgG、IgM含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，對差異顯著者采用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以平均值±標準差表示，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 GA對肉仔雞血清CD4分子含量的影響

由表2可知，21～49日齡時，與空白對照組相比，其余5組肉仔雞血清CD4分子含量均極顯著下降(P<0.01)，尤其是LPS組，下降幅度最大。與LPS組相比，APS組和3個GA組肉仔雞血清CD4分子含量均有所升高，其中GAH組的升高幅度與APS組最接近，且均極顯著或顯著高于LPS組(P<0.01；P<0.05)；在3個GA組間，肉仔雞血清CD4分子含量均隨GA添加量增加而升高，尤其是在42日齡時，GAH組與APS組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 肉仔雞血清CD4分子含量檢測結(jié)果

2.2 GA對肉仔雞血清CD8分子含量的影響

由表3可知，21～49日齡時，與空白對照組相比，其余5組肉仔雞血清CD8分子含量均有所升高，尤其是LPS組升高幅度最大，且極顯著高于空白對照組(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個GA組肉仔雞血清CD8分子含量均極顯著或顯著降低(P<0.01；P<0.05)，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，且兩組間無顯著差異(P>0.05)；在35和49日齡時，GAH組肉仔雞CD8分子含量與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。

表3 肉仔雞血清CD8分子含量的檢測結(jié)果

2.3 GA對肉仔雞血清IgA含量的影響

由表4可知，21～49日齡時，與空白對照組相比，其余5組肉仔雞血清IgA含量均有所升高，尤其是LPS組升高幅度最大，且極顯著高于空白對照組(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個GA組肉仔雞血清IgA含量均極顯著降低(P<0.01)，且3個GA組隨GA添加量增加肉仔雞血清IgA含量呈降低趨勢，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，除35日齡外，其他日齡時兩組間均無顯著差異(P>0.05)；在21和49日齡時，GAH組與空白對照組差異均不顯著(P>0.05)。

表4 肉仔雞血清IgA含量的檢測結(jié)果

2.4 GA對肉仔雞血清IgG含量的影響

由表5可知，21～49日齡時，與空白對照組相比，其余5組肉仔雞血清IgG含量均有所升高，尤其是LPS組升高幅度最大，且極顯著高于空白對照組(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個GA組肉仔雞血清IgG含量均極顯著降低(P<0.01)，且3個GA組隨GA添加量增加肉仔雞血清IgG含量呈降低趨勢，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，除28日齡外，其他日齡時兩組間均無顯著差異(P>0.05)；在35日齡時，GAH組與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。

表5 肉仔雞血清IgG含量的檢測結(jié)果

2.5 GA對肉仔雞血清IgM含量的影響

由表6可知，21～49日齡時，與空白對照組相比，LPS組、GAL組和GAM組肉仔雞血清IgM含量極顯著升高(P<0.01)；與LPS組相比，APS組和3個GA組肉仔雞血清IgM含量均極顯著降低(P<0.01)，且3個GA組隨GA添加量增加肉仔雞血清IgM含量呈降低趨勢，其中GAH組的降低幅度與APS組最接近，除42日齡外，其他日齡時兩組間均無顯著差異(P>0.05)；在21日齡時，GAH組與空白對照組差異不顯著(P>0.05)。

表6 肉仔雞血清IgM含量的檢測結(jié)果

3 討 論

CD4分子主要由輔助性T淋巴細胞(Th1、Th2)表達，在MHCⅡ分子進行抗原遞呈時，可參與T細胞對抗原的識別、信號傳遞等,同時促進T細胞活化，因此CD4分子與細胞免疫關(guān)聯(lián)密切[10]。CD8分子主要由細胞毒性T淋巴細胞表達,通過MHCⅠ等多種途徑對識別抗原、裂解靶細胞具有重要作用[11]。LPS是目前較為常用的免疫應(yīng)激模型的造模劑[12-13],尤其在建立肉仔雞的免疫應(yīng)激模型時，效果較好[14-15]，能夠誘導動物機體中樞和外周細胞因子的升高和多種炎性細胞因子的分泌。Wang等[7]試驗結(jié)果表明，GA能夠通過核因子κB(NF-κB)和JNK信號通路激活雞的巨噬細胞系統(tǒng)，提高細胞免疫因子等的表達水平。王元元等[16]研究表明，GA可對小鼠的免疫功能進行調(diào)節(jié)。此外，GA與腎上腺皮質(zhì)激素的結(jié)構(gòu)相似，功能相近，對于糖皮質(zhì)激素受體(GR)同時具有激動和頡頏作用[17]。楊思雨[18]研究發(fā)現(xiàn)，復方甘草酸苷治療兒童肺炎后，CD4+、CD8+細胞水平降低、CD4+/CD8+細胞水平升高并接近正常。洪安林[19]研究發(fā)現(xiàn)，紫外線光療聯(lián)合復方甘草酸銨加消銀顆粒治療銀屑病時CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴細胞亞群水平高于對照組。郭凡溪[20]研究發(fā)現(xiàn)，復方甘草酸單胺粉可緩解因LPS聯(lián)合恩諾沙星的炎癥模型中雞外周血T細胞亞群紊亂。本試驗結(jié)果顯示，LPS誘導的黃羽肉仔雞體內(nèi)免疫應(yīng)激模型效果良好，對血清CD4分子含量降低和CD8分子含量的升高作用極顯著；而GA各組對緩解以上現(xiàn)象均有較好效果，說明GA同其相關(guān)物如甘草酸苷、甘草酸單胺、復方甘草酸銨等在T淋巴細胞參與的免疫方面具有相似作用；與具有增強免疫作用的APS組相比較，GAH組CD8和CD4分子含量與APS組接近，可見其免疫調(diào)節(jié)作用較好，且存在劑量效應(yīng)。此外，CD4分子含量隨時間的動態(tài)變化方面表現(xiàn)為各組總體上均在28與42日齡呈現(xiàn)下降趨勢，其原因可能是28日齡時藥效的作用還未達到峰值，而42日齡時藥效的作用已經(jīng)不明顯；CD8分子含量隨時間的動態(tài)變化方面表現(xiàn)為各組總體上均在35日齡呈現(xiàn)下降趨勢，可能此時應(yīng)激損傷的強度最大，但其機制有待進一步研究。

免疫球蛋白廣泛分布在動物機體內(nèi)環(huán)境和分泌物中，結(jié)構(gòu)與抗體相似，具有免疫活性。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激肉仔雞后其血清IgG含量明顯升高。李國軍[22]研究發(fā)現(xiàn)，LPS造成的免疫應(yīng)激可顯著升高黃羽肉雞的血清IgG和IgM含量。李昆[23]研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞注射LPS后引起了肉仔雞的免疫系統(tǒng)過度活化，從而使體液免疫中血清IgA和IgG的含量明顯升高。丁艷[24]研究發(fā)現(xiàn)，對京紅1號蛋雛雞腹腔注射LPS后其血清中IgG、IgA以及CD4的含量顯著提高。毛予龍[25]研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸苷可顯著上調(diào)小鼠回腸中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)以及血清白細胞介素-6(IL-6)、IL-10、IL-12與γ干擾素(IFN-γ)的含量，增強免疫功能。朱萬剛等[26]研究發(fā)現(xiàn)，甘草浸膏粉能顯著提高豬瘟疫苗免疫后斷乳仔豬的豬瘟病毒抗體(CSFV-Ab)、IgM、IgA、IgG含量，同時可以降低料重比，提高仔豬免疫力，增加斷奶后仔豬外周血中的紅細胞數(shù)量。司常云[27]研究發(fā)現(xiàn)，α體GA制劑在治療自身免疫性肝炎的過程中，患者高于正常指標的IgG、C反應(yīng)蛋白、γ-球蛋白等顯著下降。本試驗結(jié)果顯示，LPS誘導的黃羽肉仔雞體內(nèi)免疫應(yīng)激模型在血清IgA、IgG、IgM升高方面效果良好，與李昆[23]和丁艷[24]的研究結(jié)果一致，而GA各組對緩解以上現(xiàn)象均有較好效果，說明GA同甘草酸苷、甘草浸膏粉及部分GA制劑具有相似作用。與公認具有增強免疫作用的APS組相比，3個濃度的GA在緩解LPS刺激引起的黃羽肉仔雞血清IgA、IgG、IgM升高方面均具有極顯著的效果，其中GAH組IgA、IgG和IgM含量與APS組接近，可見其免疫調(diào)節(jié)效果好。但GA在肉仔雞中應(yīng)用的最佳劑量和作用機制仍有待進一步研究。

綜上所述，GA具有較好的免疫增強效果，其具有多種藥理作用，與傳統(tǒng)免疫增強藥物APS的效果相近時劑量卻遠低于APS，可見其具有較大研究意義，本課題組率先研究了GA對黃羽肉仔雞的免疫作用，豐富了GA作為畜禽添加劑應(yīng)用的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗表明，肉仔雞飼糧中添加80、100和120 mg/kg BW GA時可緩解LPS造成的免疫系統(tǒng)過度活化引起的血清IgA、IgG、IgM異常升高現(xiàn)象，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，且其免疫調(diào)節(jié)能力有劑量效應(yīng)。