bta-miR-377靶向調控牛下丘腦CART基因表達的研究

任 靜，郝琴琴，成俊麗，朱芷葳，許冬梅，賈雪純，李鵬飛

(山西農業大學生命科學學院，太谷 030801)

牛是單胎動物，每個發情周期內通常只有一個優勢卵泡能夠發育成熟，并最終排卵受精，其他卵泡則會在發育過程中走向閉鎖[1]。發情周期內卵巢發育卵泡數量和質量直接關系到母牛的繁殖性能。前期研究發現，由下丘腦分泌的可卡因-苯丙胺調節轉錄肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)是卵泡發育過程中的重要調節因子，對牛卵泡發育起負調控作用[2-3]。CART通過下丘腦-垂體-卵巢軸作用于卵巢中的卵泡顆粒細胞(granulesa cells,GCs)，促進GCs凋亡，最終導致卵泡閉鎖[4]，但目前對影響CART表達的分子調控機制鮮見報道。

microRNA(miRNA)是一種由20個左右的核苷酸組成的小分子非編碼RNA，能夠與靶基因的部分或全部序列以堿基互補配對的方式相結合，導致mRNA降解并抑制其翻譯。幾乎所有編碼mRNA產物的成熟序列都具有能夠與miRNA結合的反應元件，表明miRNA在動物生理和病理過程中發揮著重要作用[5]。近年來大量研究表明，miRNA能夠調控卵泡發育，Wright等[6]發現，miR-21能夠抑制豬卵母細胞中程序性死亡因子PDCD4的表達進而影響卵母細胞的發育；在豬卵泡膜細胞中，miR-1275可通過抑制芳構化酶CYP19A1的表達來影響雌二醇(E2)分泌，促進GCs凋亡[7]。Zhang等[8]對多胎和單胎綿羊下丘腦中mRNA和miRNA差異譜進行分析，發現促甲狀腺素釋放激素、促性腺素釋放激素和催乳素等與動物生殖相關的激素，以及能夠調控這些激素表達的miRNA，如oar-miR-379-5p、oar-miR-152、oar-miR-432等均存在差異表達；進一步構建相應的下丘腦miRNA-mRNA調控網絡發現，miRNA通過調控下丘腦中激素分泌影響卵泡發育，并對綿羊繁殖能力產生影響。以上結果表明，miRNA在不同動物體內的不同部位發揮作用，對卵泡發育相關激素合成及其分泌產生影響，進而調控卵泡發育。

本研究在明確bta-miR-377與CART 3′-UTR區靶向結合關系的基礎上，進一步探究bta-miR-377對CART表達的調控作用。通過探討bta-miR-377與牛CART 3′-UTR區的靶向作用關系及作用效果，明確牛下丘腦CART表達的上游調控機制，完善分子調控網絡。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于山西文水縣肉牛屠宰場選擇3頭正常發情的健康西門塔爾母牛，屠宰后采集下丘腦組織，用滅菌DPBS洗滌2次后投入液氮中速凍，帶回實驗室處理。

1.2 主要試劑和儀器

293T和PC12細胞均由山西農業大學生命科學學院實驗室保存；pGP-miRGLO質粒購自Promega公司；miRNA莖環法第一鏈cDNA合成試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPCR MasterMix購自北京康為世紀生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TransIntroTMEL購自北京全式金生物技術股份有限公司。GloMax Multi酶標儀購自Promega公司；熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學分析 利用RNAhybrid軟件預測并分析牛CART mRNA 3′-UTR區與bta-miR-377的結合情況及其二級結構，通過TargetScan數據庫在線預測多個物種CART mRNA 3′-UTR區與bta-miR-377的結合位點；并對bta-miR-377與大鼠miR-377(rno-miR-377)進行序列相似性比對。

1.3.2 引物設計與合成 在NCBI中查詢獲得牛CART mRNA序列(GenBank登錄號：NM_001007820)，在miRBase數據庫中查詢獲得bta-miR-377、rno-miR-377-3p、rno-miR-377-5p成熟序列，根據牛CART mRNA基因組預測序列及bta-miR-377成熟序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.3 下丘腦組織總RNA提取及PCR擴增 利用Trizol法提取牛下丘腦組織總RNA并進行反轉錄，以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增。利用莖環法對bta-miR-377的表達進行分析，參照說明書配制反轉錄反應體系20 μL：2×miRNA L-RT Solution mix 10 μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5 μL，總RNA 4 μL，bta-miR-377 RT引物1 μL，RNase-free ddH2O 3.5 μL。反轉錄反應條件為：16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min使酶失活。PCR反應體系20 μL：2×TaqMasterMix 10 μL，cDNA 3 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 4 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，退火1 min(溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃終延伸5 min。

表1 引物信息

1.3.4 重組質粒構建 根據bta-miR-377成熟序列的種子區域獲取靶位點突變的插入序列，由上海吉瑪公司合成野生型和突變型插入片段(圖1)及bta-miR-377 mimics，用限制性內切酶XhoⅠ和SacⅠ切割目的片段和骨架載體pGP-miRGLO，將經過連接回收并純化后的切割產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，選取經藍白斑篩選并測序正確的菌落進行質粒抽提，野生型與突變型重組質粒分別命名為pGP-CART-WT和pGP-CART-Mut。

方框部分表示bta-miR-377對應的結合位點和突變位點

1.3.5 雙熒光素酶報告載體試驗 將構建好的雙熒光素酶報告載體與bta-miR-377 mimics參照TransIntroTMEL的操作說明共轉染293T細胞，培養30 h后裂解細胞，用雙熒光素酶檢測試劑盒測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.3.6 細胞培養及轉染 選擇處于對數生長期的PC12細胞，以5×105/孔的密度接種于6孔板，待細胞匯合度達到80%～90%后進行轉染。用DMEM培養基分別稀釋bta-miR-377 mimics、NC mimics和轉染試劑，室溫孵育5 min后再混合孵育20 min，加入6孔板中。將細胞在37 ℃、5% CO2條件下培養6 h后更換正常培養基，再培養48 h。

1.3.7 牛CART基因實時熒光定量PCR反應 提取上述PC12細胞中的總RNA，參照1.3.3中方法對轉染bta-miR-377 mimics的試驗組及轉染NC mimics的陰性對照組中的bta-miR-377進行特異性擴增，檢測bta-miR-377的表達情況，對轉染效果進行判斷。通過實時熒光定量PCR對試驗組及對照組中牛CART基因的表達量進行檢測，并以β-actin作為內參基因，引物信息見表1。PCR反應體系10 μL：2×TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算CART mRNA在PC12細胞中的相對表達量。

1.3.8 Western blotting檢測CART蛋白表達 將bta-miR-377 mimics、NC mimics分別與CART過表達載體共轉染293T細胞后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量后取50 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠10%，濃縮膠5%)、轉膜、室溫下封閉后，加入CART抗體(1∶500稀釋)過夜孵育，加入山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋)搖床孵育1 h；滴加化學發光液后進行顯影并采集圖像，利用Image J對圖像進行分析，計算CART蛋白相對表達量。

1.3.9 數據統計及分析 每個試驗均設置3個重復組，結果采用平均值±標準誤表示，對雙熒光素酶報告基因試驗結果進行單因素方差分析，對實時熒光定量PCR結果進行獨立樣本t檢驗，并利用GraphPad Prism 9.0軟件繪制直方圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 牛CART與bta-miR-377靶向結合位點預測及二級結構預測

經TargetScan數據庫預測確定bta-miR-377能夠靶向結合牛CART 3′-UTR區，結合位點在161―167 bp區域，信噪比為-0.42(圖2)，表示結合性較強；進一步分析發現，在包括大鼠在內的多種哺乳動物中，bta-miR-377與CART 3′-UTR區的結合位點高度保守，序列為UGUGUGAA。

圖2 bta-miR-377與CART 3′-UTR結合位點及信噪比

利用RNAhybrid軟件進一步預測二者結合的二級結構，結果顯示，bta-miR-377的種子序列2～8 nt與牛CART 3′-UTR區完全互補配對，位于5′-端的首個核苷酸所對應的靶基因的核苷酸為A，且結合位點最小自由能為-90 kJ/mol(圖3)，符合靶位點預測條件。

圖3 bta-miR-377與牛CART 3′-UTR結合的二級結構

2.2 bta-miR-377與rno-miR-377序列相似性比對

bta-miR-377與rno-miR-377序列比對結果顯示，miR-377在牛與大鼠中的種子區序列不一致，保守性較低，表明PC12細胞中內源的rno-miR-377不會影響bta-miR-377與CART 3′-UTR的結合，對后續試驗結果無影響，故在本研究的細胞轉染過程中不必設計inhibitor組。

2.3 牛下丘腦bta-miR-377與CART基因內源性表達分析

以牛下丘腦cDNA為模板，PCR擴增結果顯示，bta-miR-377經莖環法特異性擴增后產物條帶約為70 bp(圖4A)，CART基因PCR擴增產物條帶約為728 bp(圖4B)，均與預期結果相符。

M，DNA Marker；1～3，目的產物

2.4 雙熒光素酶報告基因驗證靶標關系

分別共轉染bta-miR-377 mimics與重組質粒及空質粒，并設置NC mimics作為陰性對照組。結果顯示，轉染空白質粒時bta-miR-377 mimics和NC mimics兩組間熒光活性無明顯差異(圖5)，表明試驗體系穩定，結果可靠。bta-miR-377 mimics+pGP-CART-WT共轉染的相對熒光素酶活性與NCmimics+pGP-CART-WT相比差異極顯著(P<0.01)，而pGP-CART-Mut與bta-miR-377共轉染時，其相對熒光素酶活性與對照組無顯著差異(P>0.05)。表明bta-miR-377在CART基因3′-UTR區存在結合位點，CART是bta-miR-377的靶基因。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.5 轉染后PC12細胞中bta-miR-377與CART的表達分析

PC12細胞轉染后，收集細胞提取總RNA，對bta-miR-377 mRNA的表達量進行檢測，結果顯示，bta-miR-377 mRNA在試驗組中高表達，在對照組中無表達(圖6A)，與預期結果一致，說明細胞轉染成功。轉染bta-miR-377 mimics后的試驗組與轉染NC mimics的對照組相比，試驗組PC12細胞中CART基因mRNA表達量極顯著降低(P<0.01，圖6B)，表明bta-miR-377能夠抑制神經元細胞內源CART基因mRNA的表達。

M,DNA Marker；1～3，試驗組PCR產物；4～6，對照組PCR產物

2.6 bta-miR-377對293T細胞中CART蛋白表達的影響

Western blotting檢測結果顯示，與NC mimics相比，轉染bta-miR-377 mimics的293T細胞中的CART蛋白表達量顯著降低(P<0.05，圖7)，表明bta-miR-377能夠在蛋白水平抑制CART的表達。

A，Western blotting檢測結果；B，Image J灰度分析結果

3 討 論

miRNA是一類在進化上較為保守的內源性非編碼RNA，一般由18～25個核苷酸組成，能夠與靶基因mRNA的3′-UTR區、5′-UTR區或CDS區結合調控目的基因表達。miRNA的調控機制可分為兩類：與靶基因mRNA完全互補配對導致其降解，在轉錄后水平抑制表達；或與mRNA不完全互補配對直接抑制其翻譯，在翻譯水平抑制表達。目前對miRNA的研究主要集中在各類癌細胞的成因、擴散及靶向藥物研發等方面[9-11]。miR-377是近年來發現的一種重要的miRNA分子，對多種癌細胞生長具有抑制作用[12-14]，miR-377還能夠通過調控與血管生成相關因子VEGF的生成抑制大鼠缺血性腦損傷[15]；抑制miR-377表達可以減少由于藥物引起的心肌細胞凋亡[16]。在調控動物卵泡發育方面，Zhang等[17]證實oar-miR-377和oar-miR-485-3p可與綿羊卵巢中的PTX3靶向結合，降低PTX3表達量，影響卵母細胞的質量。本研究發現，bta-miR-377與CART在牛下丘腦組織中均有表達，經生物信息學手段和雙熒光素酶報告基因法明確二者靶向結合關系后，認為bta-miR-377能夠在牛下丘腦中與CART基因mRNA的3′-UTR區靶向結合，影響CART的表達。

動物卵泡在生長發育過程中所需的營養物質主要由包裹在其外周的GCs提供，GCs的凋亡是卵泡閉鎖的一個重要表現[18]。下丘腦分泌的各類神經肽能夠通過調控垂體中促性腺素分泌[19]、卵泡GCs增殖凋亡[20]、E2分泌[21-22]等過程調控動物卵泡發育。前期研究發現，CART在牛優勢卵泡中的含量低于從屬卵泡[3]；一定條件下體外培養牛卵泡GCs，在培養液中添加CART后會對GCs的生長和增殖產生影響，導致E2分泌被抑制[23-24]。經進一步高通量測序及免疫組化定位分析發現，CART基因mRNA及其多肽在不同發育階段牛卵泡GCs中表達量有顯著差異，在卵泡發育波出現偏差后，高表達的CART將抑制優勢卵泡繼續發育，因此認為CART對牛卵泡生長發育具有負調控作用[25]。近年來，為明確CART影響卵泡發育的作用機理，本課題組一直致力于篩選并鑒定位于牛卵泡GCs膜上的能夠與CART特異性結合并發揮調控作用的G蛋白偶聯受體[26-27]，而對牛下丘腦中CART表達的分子調控機制研究較少。

CART大量存在于哺乳動物的下丘腦神經核，能夠通過下丘腦-垂體-卵巢軸直接作用于卵巢GCs，因此，本研究選擇PC12細胞株作為細胞模型，該細胞株能夠在神經生長因子的誘導下發生形態及生理功能的變化[28]，形成具有內分泌功能的神經膠質細胞，且具有易培養、易轉染等特點，因此常應用于如帕金森病、阿爾茲海默癥等神經元損傷或神經系統疾病等方面的研究中[29]。目前，PC12細胞在對神經分泌性物質的研究中應用廣泛，腦源性神經營養因子(BDNF)是一種抑郁癥標志物，Zhang等[30]通過制備RNA依賴的腺嘌呤核苷脫氨酶1(ADAR1)過表達的PC12細胞株，發現ADAR1能夠通過調控miR-432轉錄顯著降低BDNF mRNA的表達豐度發揮抗抑郁作用；Zosen等[31]對PC12細胞進行體外培養，證實了細胞外調節蛋白激酶(ERK1/2)對其多巴胺分泌的抑制作用。而CART作為一種已經證實的神經肽，被檢測到在PC12細胞中高表達[32]，本研究中生物信息學分析結果顯示，bta-miR-377與rno-miR-377之間的保守性較低，且bta-miR-377與牛和大鼠CART基因3′-UTR區的結合位點序列相同，表明PC12細胞內源的rno-miR-377不會影響bta-miR-377與大鼠CART基因3′-UTR區的結合，因此本研究選擇PC12細胞作為模式細胞是合理的，通過轉染miRNA mimics使bta-miR-377在PC12細胞中過表達，結果顯示PC12細胞中CART的表達被極顯著抑制，這與Western blotting檢測bta-miR-377對CART蛋白表達影響的試驗結果一致，表明bta-miR-377能夠在基因和蛋白水平抑制CART的表達，是CART表達過程中的負調控因子，這將為深入探究CART在神經元細胞中表達的分子調控機制奠定基礎。

4 結 論

在牛下丘腦中檢測到bta-miR-377與CART基因均有表達，bta-miR-377與CART基因3′-UTR區能夠靶向結合，經細胞功能驗證明確轉染bta-miR-377 mimics能夠抑制CART基因mRNA和蛋白表達，推測bta-miR-377能夠與CART基因3′-UTR區結合進而影響CART基因mRNA轉錄。