梅花鹿茸生長過程中頂端不同組織COL1A1基因啟動子DNA甲基化模式及差異分析

張芙蕊 韓若冰 郭夢雅 趙洵武 李和平

(東北林業大學 野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040)

鹿茸是哺乳動物中唯一可完全再生的附屬器官，其生長速度極快卻沒有癌變[1]，鹿茸每年周期性再生的過程通過軟骨內成骨的方式進行，并且具有分層明顯的成骨帶，包括間充質層、前軟骨層、過渡層、軟骨層以及骨組織，Colitti等[2]研究表明鹿茸組織的細胞凋亡率較高，認為細胞程序性凋亡在鹿茸角快速再生過程中發揮了重要的作用，使鹿茸組織中細胞凋亡和細胞生長之間形成了有序的平衡機制，以此阻止其發展為腫瘤。因此鹿茸是研究哺乳動物生長發育和分子機制的優秀生物學模型[3]，同時也是癌癥生物學領域的研究模型[1]。

COL1A1基因是細胞外基質受體相互作用途徑中的重要基因，在調控生物體生長發育，以及在癌細胞系轉移和癌癥患者預后標志預測等領域中具有重要的作用。本團隊此前已研究分析了馴鹿鹿茸頂端間充質中COL1A1基因的DNA甲基化水平，結果表明COL1A1基因可能是馴鹿生茸機制的重要調控基因[4]。Stéger等[5]研究發現，COL1A1基因等調控生長相關基因在馬鹿鹿茸中的表達量是鹿角表達量的10倍以上；趙姬臣[6]對狍茸頂端組織轉錄組分析篩選出COL1A1基因存在高表達現象，表明COL1A1基因在鹿茸生長過程中可能存在重要調控作用。DNA甲基化是一種哺乳動物中重要的表觀遺傳修飾，不僅在不改變DNA序列的前提下對基因的遺傳和表達進行調控，而且這種調控作用可以在世代間穩定遺傳[7]，基因啟動子區甲基化水平的變化可以直接抑制基因與轉錄因子的結合，進而調控特定基因的轉錄和表達水平[8]。并且已有研究表明COL1A1基因啟動子對DNA甲基化十分敏感[9]，但COL1A1基因在鹿茸中甲基化水平對鹿茸生長是否發揮作用尚不清楚。因此進一步研究鹿茸頂端組織中COL1A1基因啟動子的DNA甲基化水平，可能揭示鹿茸中COL1A1基因對其生長的差異調控作用。

因此，本研究以梅花鹿鹿茸生長過程中的3個不同生長時期(前期：小鞍子時期;中期：二杠茸時期;后期：三杈茸時期)的頂端組織及其4個不同組織層(茸皮組織、間充質組織、前軟骨組織、軟骨組織)作為試驗材料，利用亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)對COL1A1基因啟動子區部分序列甲基化水平進行測定，以分析COL1A1基因在梅花鹿鹿茸不同生長時期和頂端不同組織層中甲基化水平的差異，為進一步研究鹿茸生長、再生和骨化等調控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

本研究選用3頭5歲成年健康雄性梅花鹿，分別在脫盤后的30、60和90 d左右采集梅花鹿生茸前期(小鞍子時期)、生茸中期(二杠茸時期)和生茸后期(三杈茸時期)鹿茸主干頂端5 cm左右的組織，參考Li等[10]對鹿茸頂端組織分層方法，分出茸皮層、間充質層、前軟骨層和軟骨層4種組織，總共36個樣本。組織樣品采集后立即放入液氮中保存。

1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒(RMI060002604)購自AXYGEN公司；甲基化基因組處理試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit，D5005)購自ZYMO RESEARCH公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(D2500-02)購自Omega公司；DL 2000 Plus DNA Marker(MD101-01)購自Vazyme公司；rTaq DNA聚合酶(R001A)，Hot Start Taq DNA聚合酶(R007A)，DH5α感受態細胞(CB101)，pMD18-T載體(6011)，6×Loading Buffer，dNTP Mix(2.5 mM)，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)購自TaKaRa公司。

1.3 試驗方法

1.3.1基因組DNA的提取與檢測

使用基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取基因組DNA。提取DNA后分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000測定DNA的質量以及純度和濃度。其中DNA濃度均應在200～500 ng/μL，利于后續的甲基化處理獲得最佳CT轉化率。

1.3.2重亞硫酸鹽修飾基因組DNA

使用甲基化基因組處理試劑盒對基因組DNA進行轉化修飾處理。注意按照說明配置CT轉化液，其在使用前應水浴加熱到37 ℃，并震蕩混勻，防止由于CT轉化液形成沉淀而影響甲基化修飾的CT轉化率。最后，得到處理后基因組DNA立即用于甲基化PCR擴增。

1.3.3BSP甲基化引物設計

使用在線軟件http:∥www.urogene.org/methprimer/和Primer 5.0對OPN基因啟動子區域的CpG島進行分析預測和引物設計。其中上游引物是5’-GGTTTAGATTGAATTGGGGG-3’，下游引物是5’-TAACCTTCTTCTTAACCCTCC-3’，退火溫度是53.5 ℃。在亞硫酸氫鹽處理的甲基化PCR引物擴增區域內，含一個長度201 bp的CpG島，共有25個CG位點，預期擴增大小441 bp。

1.3.4COL1A1基因甲基化PCR的擴增及測序

以重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA為模版，進行甲基化PCR的擴增。PCR反應體系為(10 μL)：Hot start Taq DNA聚合酶0.05 μL，DNA模板1 μL，10×PCR Buffer 1 μL，dNTP Mix 0.8 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 6.15 μL。反應程序為：98 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存備用。

得到的擴增產物進行回收純化后與pMD18-T載體進行連接，連接體系為(10 μL)：solution 1 5 μL，PMD-18T vector 1 μL，回收產物3.5 μL，ddH2O 0.5 μL，16 ℃連接1 h。連接完成后將連接產物10 μL 與DH5α感受態細胞50 μL按步驟進行轉化。培養的菌液均勻涂布在LB固體培養基上，37 ℃恒溫培養15～17 h。用槍頭挑取單一飽滿的白色菌落于1.5 mL含Amp的LB液體培養基中，置于恒溫搖床(37 ℃，200 r/min)培養8 h。將1 μL的DNA模板換成1 μL菌液對克隆產物進行菌液PCR，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行克隆陽性鑒定。最后，將克隆成功的10管菌液送至吉林庫美生物科技有限公司進行雙向測序。

1.3.5統計分析數據

測序結果利用Chromas查看序列峰圖，使用DNAStar軟件對序列進行人工校對和拼接，得到甲基化BSP測序結果。

將該基因甲基化BSP測序結果與啟動子序列導入在線軟件QUMA(http:∥quma.cdb.riken.jp/)，計算該基因在不同組織中的DNA甲基化轉化率，同時得到DNA甲基化模式分析的圓圈圖。

應用統計學軟件GraphPad Prism 8.0.1和IBM SPSS Statistics version 23分析各組織的甲基化總差異和各CG位點上的甲基化差異。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取及質量檢測

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測基因組DNA提取的質量。提取的基因組DNA濃度均可達到200 ng/μL以上，OD260/OD280值均在1.8～2.0。因此，鹿茸頂端各組織的基因組DNA提取質量較好，濃度和純度均可滿足試驗要求。

2.2 COL1A1基因甲基化BSP-PCR擴增及測序

分別以重亞硫酸鹽修飾處理過的梅花鹿鹿茸12個組織的基因組DNA為模板，對COL1A1基因啟動子區進行BSP-PCR擴增，擴增出的片段大小均與預期擴增大小一致，如圖1所示。測序結果利用Chromas查看序列峰圖以確認測序結果的可靠性，使用DNAStar軟件對序列進行人工校對和拼接，得到甲基化BSP測序結果，與原序列進行對比，確認測序結果正確。

M：DL 2000 marker；1～6：代表平行樣本。M: DL 2000 marker; 1-6: Parallel samples.

2.3 梅花鹿茸不同時期頂端各組織COL1A1基因的DNA甲基化模式

通過對梅花鹿鹿茸頂端組織的COL1A1基因啟動子甲基化BSP測序結果校對、分析，經統計發現，各組織的陽性克隆菌液測序結果中均有10個以上的有效測序結果，利用軟件QUMA比對分析該基因在梅花鹿鹿茸12個組織中的甲基化狀態(圖2)，并進行統計分析。結果顯示，COL1A1基因在前期、中期、后期的茸皮組織中的甲基化率分別為(9.73±0.92)%、(7.60±0.69)%和(3.73±0.23)%；間充質組織中的甲基化率分別為(3.20±0.40)%、(1.33±0.23)%和(1.60±0.69)%；前軟骨組織中的甲基化率分別為(4.67±0.83)%、(2.53±0.46)%和(2.67±0.23)%；軟骨組織中的甲基化率分別為(5.60±0.40)%、(2.80±0.40)%和(2.27±0.61)%。

每一行代表一個細菌克隆，每一圈代表一個單獨的CpG二核苷酸位點；○：未甲基化位點，●：甲基化位點。Each line represents one individual bacterial clone, and each circle one single CpG dinucleotide; ○: Unmethylated CpGs; ●: Methylated CpGs.

在COL1A1基因啟動子區DNA甲基化水平的分析區域中，共有25個CG位點，分別位于39、56、93、99、118、148、171、190、221、226、233、242、256、262、276、278、291、299、303、322、374、393、400、411和415 bp。各位點的甲基化率見表1所示，在其中的17個CG位點檢測到不同程度的甲基化。結果顯示，39、56、118、190和415 bp處在4層組織中均發生不同程度的甲基化；221 bp處只在間充質前期及中期發生甲基化；226 bp處只在間充質后期發生甲基化；233 bp處只在茸皮中期發生甲基化；242 bp處在茸皮前期、間充質前期及中期發生甲基化；262 bp處在茸皮3個時期、前軟骨前期、軟骨后期均發生不同程度甲基化；278 bp處在茸皮前期及中期、間充質前期及中期發生甲基化；291 bp處在間充質后期、軟骨前期發生甲基化；299 bp處在前軟骨3個時期、茸皮中期及后期、軟骨層前期均發生甲基化；303 bp處在茸皮中期、前軟骨中期、軟骨中期均發生甲基化；393、400和411 bp處只在茸皮前期發生甲基化。

2.4 梅花鹿茸不同時期頂端各組織COL1A1基因的DNA甲基化差異

對COL1A1基因啟動子區在梅花鹿鹿茸不同生長時期頂端各組織的DNA甲基化率進行統計以及差異分析，結果見圖3所示。對相同組織甲基化程度進行差異性比較的結果顯示，在茸皮組織中，3個時期甲基化程度之間差異均為極顯著(P<0.01)，且甲基化程度依次遞減；在間充質組織中，前期甲基化程度最高，中期減小，且與前期存在顯著性差異(0.010.05)；在前軟骨組織中，前期甲基化率最高，分別與中期、后期之間差異均為極顯著(P<0.01)，中期與后期之間無顯著性差異(P>0.05)；在軟骨組織中，前期甲基化程度最高，與中期存在顯著性差異(0.010.05)。

(a)相同組織甲基化程度差異性比較；(b)相同時期甲基化程度差異性比較；*：0.01

對相同時期甲基化程度進行差異性比較的結果顯示，在前期和中期中，茸皮甲基化程度最高，與間充質、前軟骨、軟骨之間差異均為極顯著(P<0.01)，軟骨、前軟骨、間充質甲基化程度依次遞減，且前期中間充質與軟骨之間差異極顯著(P<0.01)；在后期中，茸皮甲基化程度最高，與間充質之間差異為極顯著(P<0.01)，前軟骨、軟骨、間充質甲基化程度依次遞減。

COL1A1基因啟動子區甲基化研究區域共有25個CG位點，各位點DNA甲基化差異分析如圖4所示。對茸皮組織進行差異性分析結果發現，前期與中期在39、56、190、233、242、278、299和400 bp處差異極顯著(P<0.01)，在393和411 bp處差異顯著(0.010.05)；前期與后期在39、56、118、190、242、400和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在262、393和411 bp處差異顯著(0.010.05)；中期與后期在39、56、118、233、278和415 bp處差異極顯著，在262和299 bp處差異顯著，其余CG位點上無顯著差異。對間充質組織進行差異性分析結果發現，前期與中期在39、221、226、242、291和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在56、190和278 bp處差異顯著(0.010.05)；前期與后期在39、56、221、226、242、291和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在190和278 bp處差異顯著(0.010.05)；中期與后期在291 bp處差異極顯著(P<0.01)，在56 bp處差異顯著(0.010.05)。對前軟骨組織進行差異性分析結果發現，前期與中期在39、56、190、262、299、303和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在118 bp處差異顯著(0.010.05)；中期與后期在39、56和303 bp處差異極顯著(P<0.01)，在299 bp處差異顯著(0.010.05)。對軟骨組織進行差異性分析結果發現，前期與中期在39、56、118、190、291、299和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在303 bp處差異顯著(0.010.05)。

(a)茸皮組織；(b)間充質組織；(c)前軟骨組織；(d)軟骨組織；1：前期；2：中期；3：后期。

3 討 論

COL1A1基因具有維持骨組織、結締組織和細胞微環境完整性的作用[11]，并且其傳導多種信號分子參與器官發育和組織修復等生理過程[12]。鹿茸是研究骨組織再生和創傷修復的良好模型，而鹿茸頂端組織是鹿茸的生長中心，為探究COL1A1基因在鹿茸頂端組織生長過程中的作用機制，本研究選用梅花鹿鹿茸不同生長時期頂端組織及其由外到內依次排列的茸皮、間充質、前軟骨、軟骨4個不同組織層為研究材料，從時空角度利用亞硫酸氫鹽測序法研究了鹿茸啟動子區甲基化模式，進而分析了2個維度的甲基化差異。結果顯示，不同組織之間在總的甲基化水平和CG位點的甲基化水平上均存在不同程度的差異和明顯的規律。

COL1A1基因在4個組織中均發生了不同程度的甲基化，茸皮組織甲基化水平最高，間充質、前軟骨、軟骨組織甲基化水平都較低，其中，間充質組織甲基化水平最低，且在前期與中期茸皮組織的甲基化水平與其他3個組織之間的差異均為極顯著，表明COL1A1基因可能在茸皮組織中的生長作用相對較弱，而在頂端中心生長組織中起更重要作用。間充質生長區在鹿茸茸性皮膚真皮層的下方[13]，間充質層細胞具有極強的分裂增殖能力[14]，并且在體外培養液中能迅速增殖并合成Ⅰ型膠原蛋白[15]。本研究結果表明，間充質層在4個組織中甲基化水平最低，可能是由于間充質組織細胞間質分泌旺盛，并且221 bp這一位點只在間充質發生甲基化，221 bp位點可能是調節間充質生長的重要CG位點。已有研究表明，COL1A1基因在乳腺癌、胰腺癌、胃癌及食管癌等惡性腫瘤組織中呈高表達[16-17]，Ⅰ型膠原蛋白是細胞間質的重要成分[18]，結合鹿茸具有細胞快速增殖這一與癌細胞相似的特點，推測梅花鹿間充質中COL1A1基因可能存在高表達。

CG位點的甲基化水平會影響DNA序列與轉錄因子的結合狀態，進而影響基因的表達，而CpG島DNA高甲基化往往造成基因沉默和表達下降[19-20]。Ⅰ型膠原蛋白基因在幾種人類癌細胞中均存在不同程度的甲基化，且甲基化程度與Ⅰ型膠原蛋白表達呈負相關[9]。對間充質組織的研究結果顯示：中期甲基化水平顯著下調，后期甲基化率略高于中期，但差異不顯著。張梅等[21]對快速生長期和骨化期鹿茸間充質組織差異表達基因進行篩選，發現COL1A1基因在骨化期鹿茸間充質組織中表達下調，這與本研究結果相符，表明COL1A1基因可能在間充質快速生長期中發揮更強的作用，促進鹿茸生長。

鹿茸的生長發育階段分為生長期和骨化期，鹿茸形態從小鞍子(30 d)到三杈茸(90 d)之間為生長期，以生長為主，骨化水平緩慢，其中二杠茸(60 d)時期為快速生長期，其生長速度可達2 cm/d，三杈茸時進入骨化期，生長速度降低，骨化水平增強[22]。在4個組織中，快速生長期甲基化水平均顯著下調，且造成前期與中期差異的CG位點有39、56和118 bp等，推測COL1A1基因在快速生長期發生高表達。劉海龍[23]對鹿茸頂端組織進行轉錄組測序分析，發現細胞外基質基因中COL1A1基因在60 d快速生長期表達量升高的結果佐證了這一推論。鹿茸的快速生長與頂端的軟骨細胞的增殖、分化以及肥大密切相關[24]，前軟骨區和軟骨區具有豐富的血液供應，且在前軟骨區血管的生成更高[25-26]。在哺乳動物骨組織中COL1A1基因研究廣泛，據報道大約90%的成骨不全癥患者在COL1A1或COL1A2基因中存在雜合性變異，擾亂細胞內正常的膠原組裝、細胞分泌以及細胞外間隙的纖維組裝[27]。Fernndez等[28]研究發現COL1A1基因在16日齡雞胚胸骨的軟骨細胞中顯示甲基化相對下調，他們認為COL1A1密切參與骨及軟骨組織的生長與調控。丁玲[29]的研究表明，COL1A1基因在快速生長期和骨化期鹿茸軟骨組織中均高度表達但存在表達差異，COL1A1基因在快速生長期的表達量均高于其他篩選出的膠原蛋白類差異表達基因且達到10倍以上，在骨化期的表達量高于除COL2A1外的其他基因，證實COL1A1在軟骨組織中期、后期都對鹿茸生長發揮了有效的促進作用。本研究中軟骨組織中后期甲基化水平低，且中后期相比前期的共同差異CG位點有39、56、118、190、291、299和415 bp，這與丁玲[29]的研究結果一致，但軟骨組織中期與后期甲基化水平沒有顯著差異與丁玲的研究結果相悖，這可能是由于亞硫酸氫鹽測序法測定DNA甲基化率時基因組DNA的CT轉化率存在誤差，導致其與轉錄組測定的表達水平不完全一致。

綜上所述，本研究分析了梅花鹿鹿茸3個代表前、中、后期生長過程的鹿茸頂端不同組織間的DNA甲基化差異，結果表明COL1A1基因在快速生長期，以及在間充質組織、前軟骨組織、軟骨組織中對鹿茸生長具有促進作用，并且與COL1A1基因的甲基化位點以及COL1A1基因的甲基化率相關聯。但是試驗尚需進行COL1A1基因的表達測定來驗證COL1A1基因的DNA甲基化水平與該基因發揮促進鹿茸生長作用的關系，因此后續研究將對COL1A1進行基因和蛋白表達水平的測定，從而對COL1A1基因的作用機制進行更進一步研究。本研究在DNA甲基化水平上探究梅花鹿鹿茸不同組織的表觀遺傳差異，為進一步研究鹿茸的再生、快速生長和骨化機制提供理論參考。