二花臉豬ABCG8基因的蛋白功能與組織表達分析

周欣怡，張金璧，陳寬鳳，倪佳怡，丁 悅，徐世永，程澤信

(金陵科技學院動物科學與食品工程學院， 江蘇 南京 210000)

二花臉豬是原產于江蘇中南部地區的特色地方豬種，不僅性情溫和，耐粗飼，而且肉質優良，肌內脂肪含量高，風味濃郁。此外還具有產子率高、繁殖壽命長等優異的繁殖性能。但在優勢明顯的同時，二花臉豬具有生長速度慢、背膘厚、瘦肉率較低的特點[1-2]。相對于西方豬種，如大白豬等穩定較低的肌內脂肪含量(約2%)，成年二花臉豬的肌內脂肪含量可高達5%。Maria等[3]發現ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter)超家族成員之一的ABCG8不僅是豬脂質代謝關鍵基因，同時與肌內脂肪沉積有關。Henry等[4]發現飼料轉化率高的豬在營養物質代謝循環速度上具有優勢，而ABCG8在飼料轉化率高的豬中表達量偏低。因此，ABCG8可能在二花臉豬較慢的生長速度和高脂含量的肉質特色性狀形成中起到重要作用。

ABC轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter)，又稱ATP結合盒式蛋白，是目前已知規模最大的一類跨膜轉運蛋白超家族，在所有原核生物和真核生物中均有分布，且一般廣泛存在于細胞質膜中，擔負著細胞物質轉運功能[5]。已知的人類基因組總共含有48個ABC基因，根據不同的結構可分為7個家族，即ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF和ABCG。在人類和小鼠研究中發現，ABCG8能與ABCG5在內質網中組裝形成異源二聚體，該二聚體移動到細胞膜發揮作用，作為將膽固醇分子向細胞外運輸的通道，是維持動物體內膽固醇代謝平衡的重要分子[6]。目前對該基因的研究在植物甾醇血癥的相關研究中報道較多，而在肝細胞中，ABCG8和ABCG5的功能主要是將膽固醇分泌到膽汁中，從而抑制膽固醇的吸收，與負責膽固醇攝取的關鍵蛋白NPC1L1(膽固醇轉運蛋白)作用相反，二者共同維持機體膽固醇平衡[7-8]。ABCG8在豬分子育種和改良中具有較大潛力，然而其在豬脂質代謝中的功能研究關系尚未見報道。

本研究旨在以低生長速度和高脂含量的二花臉豬為研究對象，通過生物信息學方法對ABCG8編碼蛋白的高級結構、理化性質以及生物學功能進行分析，并通過PCR技術分析ABCG8基因在豬內臟和肌肉組織中的表達特征，為進一步研究ABCG8在豬脂質代謝中的生物學功能，并加以利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗動物 3頭約200日齡的健康雄性二花臉豬，于宿遷市沭陽縣生豬定點屠宰場常規屠宰后，采集肝、肺、腎、脾、胰、小腸、背最長肌組織樣本，用生理鹽水沖洗干凈，迅速投入液氮中保存并運回實驗室后，轉入-80℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2主要試劑與儀器 組織RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司，PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒購自南京諾唯贊公司，AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自南京諾唯贊公司。

1.2 試驗方法

1.2.1生物信息學分析 根據NCBI上豬ABCG8基因的預測序列(登錄號：XM_021087570.1)及相應預測蛋白序列(XP_020943229.1)進行生物信息學分析。ABCG8的理化性質由ProtParam(https://www.expasy.org/resources/protparam/)進行分析；ABCG8蛋N-糖基化位點及O-糖基化位點分別由NetNGlyc 1.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)和YinOYang 1.2(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?YinOYang-1.2)進行預測；信號肽位點由SignalP-5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)進行分析；蛋白磷酸化位點由NetPhos3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行預測；亞細胞定位分析由PSORT II Prediction TargetP-2.0(https://psort.hgc.jp/form2.html)進行；蛋白質跨膜結構域使用DeepTMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM)進行預測；ABCG8編碼蛋白的二級機構和三級空間構型分別由SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)進行預測；蛋白質相互作用由SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)數據庫(http://www.string-db.org/)進行分析。

1.2.2組織總RNA的提取和cDNA的合成 采用組織RNA提取試劑盒進行豬肝、肺、腎、脾、胰、背最長肌組織的總RNA提取，調整濃度后用PrimeScript RT Master Mix反轉錄試劑盒，按照說明書步驟進行第一鏈cDNA的合成，最后將溶解于超純水中cDNA樣品置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.3引物設計與組織表達分析 根據NCBI上豬ABCG8基因的預測序列(登錄號：XM021087570)和內參基因豬GADPH序列(登錄號：AF017079)，利用Primer Premier 6.0 軟件設計qRT-PCR引物，引物具體信息見表2。

熒光定量PCR反應體系20 μL：10 μL SYBR Green Master Mix(2×)，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，4 μL cDNA模板，4.4 μL ddH2O。反應條件：95℃預變性2 min、95℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個循環，每個樣品3個重復。每個組織設置3個重復。運用2-ΔΔCt方法分析qRT-PCR數據，使用Excel進行顯著性檢驗統計分析。P<0.05和P<0.01分別被認為差異顯著和極顯著。

2 結果與分析

2.1 ABCG8理化性質分析

根據ProtParam分析得出，豬ABCG8共編碼730個氨基酸，分子式為C3638H5712N982O1027S35，分子量為80 761.43 kD，理論等電點(pI)值為8.73，為不穩定蛋白(不穩定系數為46.26)。所含氨基酸種類較多，含量較高的有亮氨酸(12.6%)、甘氨酸(8.2%)、絲氨酸(7.9%)、丙氨酸(7.7%)、精氨酸(5.9%)和異亮氨酸(5.9%)等，色氨酸(1.1%)含量較低。帶負電荷殘基總數谷氨酸(Glu)+天冬氨酸(Asp)為57個，正電荷殘基總數賴氨酸(Lys)+精氨酸(Arg)為65個。ProtScale親疏水性分析結果見圖1，ABCG8第535位纈氨酸(Met)疏水性最強(3.011)，第330位精氨酸親水性最強(-2.678)，疏水性總平均值(GRAVY)為0.071，屬于疏水蛋白。

圖1 豬ABCG8的親疏水性分析Fig.1 Hydrophobicity analysis of ABCG8 in pig

2.2 ABCG8磷酸化位點分析

利用NetPhos 3.1對ABCG8進行在線分析，結果表明該蛋白存在109個潛在的N-磷酸化位點，包括73個絲氨酸(Serine)、26個蘇氨酸(Threonine)和10個酪氨酸(Tyrosine)(圖2)。YinOYang 1.2預測結果顯示該蛋白含有6個O-糖基化位點(圖3)。

圖2 ABCG8的N-磷酸化位點預測Fig.2 N-phosphorylation site prediction of ABCG8

圖3 ABCG8的O-磷酸化位點預測Fig.3 O-phosphorylation site prediction of ABCG8

2.3 ABCG8糖基化位點及信號肽分析

NetNGlyc1.0分析顯示，ABCG8在88、158和616位上存在3個N-糖基化位點，其中158位的糖基化可能性極高(圖4)。但SignalP-5.0信號肽分析結果顯示，ABCG8分泌信號肽概率極低，為0.001(圖5)，說明ABCG8不存在信號肽序列，因此即使它們含有潛在的糖基化基序，在動物體內大概率并不會被糖基化。

圖4 ABCG8的N-糖基化位點預測Fig.4 N-glycosylation site prediction of ABCG8

圖5 ABCG8的信號肽位點預測Fig.5 Site prediction of the signal peptide of ABCG8

2.4 ABCG8的亞細胞定位及跨膜結構域分析

利用PSORT II亞細胞定位結果顯示，ABCG8主要定位于細胞膜(43.50%)和內質網(26.10%)，在細胞質中分布極少(4.30%)，因此推測其為膜蛋白。使用TMHMM 2.0預測跨膜結構域，發現ABCG8存在6個顯著的跨膜結構域(圖6)，是一個多次跨膜蛋白。

2.5 ABCG8的高級結構及蛋白互作分析

SOPMA軟件分析ABCG8二級結構，分析顯示α-螺旋、βv轉角、延伸鏈和無規卷曲分別占43.01%、6.16%、14.52%、36.30%(圖7)。SWISS-MODEL在線進行三級結構建模顯示結果和二級結構預測一致(圖8)。用STRING交互式數據庫預測，ABCG8可能與ABCG5、NPC1L1、CYP7A1、NR1H3、SCARB1、SREBF2、APOA1、NR1H2、SQLE、NR1H4等10種蛋白存在相互作用關系(圖9)。

圖6 ABCG8的跨膜結構域預測 Fig.6 Prediction of the transmembrane domain ofABCG8

注：藍色豎線為α-螺旋，紫色豎線為無規卷曲，紅色豎線為延伸鏈圖7 ABCG8的二級結構預測Fig.7 Secondary structure prediction of ABCG8

圖8 ABCG8的三級結構建模Fig.8 Tertiary structure modeling of ABCG8

圖9 ABCG8的蛋白質互作分析Fig.9 Protein interaction analysis of ABCG8

2.6 ABCG8基因的組織表達譜分析

利用qRT-PCR技術檢測ABCG8基因在二花臉豬肝、肺、腎、脾、胰、小腸、背最長肌組織中的表達規律。結果顯示，以組織混合樣為參照，豬ABCG8基因僅在肝臟中高表達，在肺和腎臟中有痕量表達，而在其他組織中幾乎無法檢出，肝臟與其他組織表達量間差異極顯著。

圖10 ABCG8基因的組織表達分析Fig.10 Tissue expression analysis of ABCG8 gene

3 討論與結論

本研究通過生物信息學方法對二花臉豬ABCG8的理化性質、結構域、亞細胞定位、蛋白互作等進行了預測分析。在生物學功能方面，首先ABCG8的疏水性能和6個跨膜結構域提示該蛋白屬于一種膜蛋白，而亞細胞定位預測中細胞膜分布比率最高的結果進一步肯定了這一結論。其次，預測顯示ABCG8在內質網中也有較高分布，這與人、小鼠相關研究中顯示的ABCG8和ABCG5在內質網上形成異源二聚體的生物學過程相符[2]。這一結果進一步與蛋白互作分析結果，即ABCG5顯示為與ABCG8互作最為緊密的蛋白相互印證。最后，表達譜分析顯示了其肝臟和小腸中的顯著表達，可見豬ABCG8參與細胞膜上的膽固醇轉出這一基本功能與其在人和小鼠中基本一致[9]。

蛋白互作分析提示了豬ABCG8可能存在的其他生物學功能。如該蛋白與幾種轉錄因子，即固醇調節元件結合轉錄因子SREBF2和3個核受體超家族的NR1亞家族成員NR1H2、NR1H3和NR1H4均可能產生互作。這3種核受體互為旁系同源蛋白，且與SREBF2都主要在肝臟中起作用。其中NR1H2可直接與DNA的順式作用元件結合，參與脂肪生成相關基因的轉錄[10]；NR1H3通過與視黃酸受體(RXR)的結合激活其轉錄因子活性，參與相關基因轉錄，促進極低密度脂蛋白(VLDL)的生成[11]；NR1H4的功能更為廣泛，主要作為膽汁酸的受體，反饋調節參與膽汁酸合成和轉運的基因的表達[12]。可見豬ABCG8作為甾醇調節基因，位于幾種轉錄因子下游，可能在多種信號的觸發下啟動轉錄并發揮作用。此外，NPC1L1一般通過囊泡內吞作用將游離膽固醇吸收到細胞中，在腸道膽固醇的吸收中起關鍵作用[13]，因此其與ABCG8的互作最可能發生在內質網中，可能對ABCG8/ABCG5二聚體的組裝產生影響。另外，與ABCG8互作的清道夫受體B1基因SCARB1是高密度脂蛋白膽固醇(HDL)的質膜受體，介導膽固醇與HDL的結合和分離[14]；載脂蛋白APOA1，是血漿中HDL的主要蛋白質成分，促進膽固醇從組織運送到肝臟進行排泄，并且是卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LCAT)的輔助因子[15]，由此可見ABCG8可能與多種蛋白在脂質代謝中相互協作，是脂質代謝的核心蛋白之一，可能在豬的脂類沉積過程中起重要作用。

綜上，本研究以生物信息學方法分析了二花臉豬ABCG8的理化性質、高級結構和基本功能，預測了其在豬脂質代謝中的生物學功能和互作通路，為進一步研究ABCG8自身功能以及發掘其在豬生長性能和肉質性能調控中的機理，開發其在育種中的應用潛力研究奠定了基礎。