二甲雙胍對具核梭桿菌與結(jié)直腸癌的影響

魏攀鳳 張小燕

根據(jù)全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)直腸癌（colorectal cance,CRC）的發(fā)病率和死亡率在近年來一直處于明顯上升趨勢，在全球癌癥中位居第三，死亡率第二。從疾病發(fā)展趨勢角度根據(jù)不同年齡和區(qū)域進(jìn)行分析統(tǒng)計，年輕人的患病率升高，且與往年發(fā)病水平相比發(fā)病率有所上升。CRC發(fā)生和后續(xù)發(fā)展與環(huán)境、遺傳因素、不良飲食結(jié)構(gòu)、腸道微生物群體失衡[1-2]、腸黏膜發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)等有關(guān)，各種危險因素相互作用而引起機(jī)體結(jié)直腸惡性腫瘤的產(chǎn)生[3]。具核梭桿菌（fusobacterium nucleatum, Fn）是CRC發(fā)生的可疑病原體之一，具體的致病機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。目前，有報道指出Fn的腸道感染途徑為通過致病菌異常定植在腸道黏膜中致使腸黏膜發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)[4]，并激活機(jī)體免疫應(yīng)答從而導(dǎo)致惡性細(xì)胞生成，F(xiàn)n與CRC發(fā)展和疾病轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，Cuellar-Gómez等[5]的研究表明，在CRC患者中Fn明顯富集的患者淋巴轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率均高于平均水平。

二甲雙胍是目前全球臨床上應(yīng)用最為廣泛的2型糖尿病口服藥物，進(jìn)入機(jī)體后主要分布于肝臟，藥物作用機(jī)制是抑制肝臟葡萄糖異生。目前有實驗表明二甲雙胍聯(lián)合抗腫瘤藥物使用能使細(xì)胞周期停滯[6-8]，異常激活A(yù)MPK通路和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）等通路[9]。其還可通過降低機(jī)體胰島素水平起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖和有絲分裂[10]，減少機(jī)體脂肪組織生成從而抑制由脂肪細(xì)胞介導(dǎo)的惡性腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移。Huang等[11]給予4～5周的小鼠二甲雙胍（250 mg/kg）每天口服灌喂和Fn（109菌落單位）每周2次共同持續(xù)喂養(yǎng)12周，于18周后進(jìn)行結(jié)腸組織檢測發(fā)現(xiàn)給予二甲雙胍組結(jié)腸結(jié)瘤數(shù)減少、瘤體積較小，在組織學(xué)上減輕了Fn誘導(dǎo)瘤的形成。綜上表明二甲雙胍對腸道微生物組成和代謝功能障礙均有一定的影響，其可降低惡性細(xì)胞增殖，抑制腸道腫瘤形成和逆轉(zhuǎn)Fn誘導(dǎo)的腫瘤形成。

E-cadherin是一種Ca2+依賴黏附糖蛋白，為單程跨膜蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞間黏附。其表達(dá)缺失是細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）最重要的標(biāo)志性變化，也是上皮腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、遷移的前提條件[12]。有實驗報道發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可誘導(dǎo)CRC腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞-細(xì)胞黏附連接的重建[12-13]，表現(xiàn)為 E-cadherin、p120-catenin和β-catenin 定位修飾。且隨著黏著斑激酶（FAK）的抑制，毒力因子FadA黏附素與E-cadherin蛋白結(jié)合，激活β-catenin因子，介導(dǎo)致病菌附著和侵襲上皮細(xì)胞，刺激腫瘤細(xì)胞的生長。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人CRC細(xì)胞株SW480購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Fn ATCC25586菌株購自美國ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；二甲雙胍購自美國Sigma公司；兔抗人E-cadherin單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

將CRC標(biāo)準(zhǔn)菌株SW480細(xì)胞在10%胎牛血清和含抗DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、10% CO2培養(yǎng)，胰酶消化傳代生長，配成8×105/ml的細(xì)胞懸液24孔板培養(yǎng)24 h后備用分組。Fn調(diào)節(jié)成濃度1×108/ml備用。將癌細(xì)胞密度配置為1×105接種直96孔板中，根據(jù)實驗要求分組，對照組：SW480組；Fn組：Fn+SW480組[細(xì)胞與菌比例按照感染復(fù)數(shù)（MOI）（100∶1）共培養(yǎng)]；二甲雙胍組：二甲雙胍+SW480（二甲雙胍5 mmol/L）；聯(lián)合組：二甲雙胍+Fn+SW480[細(xì)胞與菌比例按照MOI（100∶1），二甲雙胍5 mmol/L]。用MTT法采用吸光度OD值（490 nm）計算24 h、48 h、72 h活細(xì)胞數(shù)。另各組培養(yǎng)處理至48 h用Western blotting檢測法，以內(nèi)參的灰度值作為對比，取對比值作為E-cadherin蛋白相對表達(dá)量，以上實驗重復(fù)3次檢測取其均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多組比較采用單向方差分析，兩兩比較用最小顯著差異法（LSD）t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對SW480增殖的影響

相對于對照組和Fn組，含二甲雙胍的培養(yǎng)組24 h、48 h及72 h均出現(xiàn)OD值明顯低于對照組和Fn組（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 二甲雙胍對SW480增殖的影響(n=5,±s)

表1 二甲雙胍對SW480增殖的影響(n=5,±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與Fn組比較，bP＜0.05

組別 24 h 48 h 72 h對照組 0.42±0.05 0.53±0.07 0.59±0.06 Fn組 0.45±0.02a 0.69±0.07a 0.85±0.07a二甲雙胍組 0.39±0.02ab 0.37±0.05ab 0.34±0.04ab聯(lián)合組 0.40±0.01ab 0.41±0.03ab 0.40±0.03ab F值 12.215 1 009.915 6 076.907 P值 0.02 0.000 0.000

圖1 二甲雙胍對SW480細(xì)胞增殖的影響

2.2 二甲雙胍對SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

與對照組和Fn組比較，二甲雙胍組、聯(lián)合組E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 二甲雙胍對SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

表2 二甲雙胍對SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響(n=3,±s)

表2 二甲雙胍對SW480細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)的影響(n=3,±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05；與Fn組比較，bP＜0.05

組別 E-cadherin蛋白對照組 1.35±0.10 Fn組 1.21±0.02二甲雙胍組 1.86±0.10ab聯(lián)合組 1.62±0.15ab F值 23.775 P值 0.00

3 討論

CRC是目前臨床上最常見的惡性腫瘤之一，病理機(jī)制目前尚未明確，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致CRC患者死亡的主要原因。CRC的發(fā)生是多種因素造成的[14-15]。EMT是腫瘤細(xì)胞形成標(biāo)志物之一，并導(dǎo)致侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，無創(chuàng)有效的篩查和高效治療方案還未發(fā)現(xiàn)，因此探究CRC發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制及轉(zhuǎn)歸對于未來制定預(yù)防、篩查和治療策略至關(guān)重要。

本實驗通過建立二甲雙胍（5 mmol/L）與Fn和SW480（MOI：100∶1）共培養(yǎng)，記錄24 h、48 h、72 h的OD值，結(jié)果表明Fn可以促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖，二甲雙胍能抑制CRC的增殖；其作用在48～72 h明顯高于24 h。其可能的作用機(jī)制是二甲雙胍對腫瘤細(xì)胞EMT具有抑制潛能。因E-cadherin是細(xì)胞EMT的主要標(biāo)志物，能表達(dá)致病體的侵襲和遷移能力從而逆轉(zhuǎn)EMT途徑[16-17]，故也被確定為疾病治愈的影響因素。另有動物實驗表明二甲雙胍可通過調(diào)節(jié)腸道微生物菌群的組成抑制腸癌的發(fā)生[18]。二甲雙胍通過調(diào)節(jié)菌群起到抑制炎癥反應(yīng)促發(fā)細(xì)胞增殖途徑的潛在作用。本實驗顯示二甲雙胍抑制腫瘤細(xì)胞生長在聯(lián)合組中也體現(xiàn)減輕了Fn誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖，考慮是否存在逆轉(zhuǎn)Fn誘導(dǎo)的致瘤性。同時發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-cadherin在聯(lián)合組中的表達(dá)量也比對照組和Fn組高，提示二甲雙胍可促使腫瘤細(xì)胞與E-cadherin結(jié)合，抑制Fn附著和侵入上皮細(xì)胞，從而降低CRC的發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移。

綜上所述，二甲雙胍可能通過促使腫瘤細(xì)胞與E-cadherin結(jié)合，抑制Fn附著和侵入上皮細(xì)胞，從而降低CRC的發(fā)生和浸潤轉(zhuǎn)移。