機械—酶消化法制備大鼠膈肌單細胞懸液的最佳消化酶濃度組合篩選

何杰，王寧，張杉杉，劉青鈴，周舟，陳謖，吳學東

1 攀枝花學院附屬醫院普外科，四川攀枝花 617000；2 大理大學第一附屬醫院小兒外科

膈肌是身體最主要的呼吸肌，在正常潮式呼吸中，大約80%的呼吸工作由膈肌完成。除參與呼吸運動外，膈肌還可以通過調節腹內壓參與調節姿勢穩定性；膈肌收縮引起腹壓增加，有助于排尿、排便和分娩；膈肌還與血液循環系統以及淋巴液的回流相關［1］。因此，從細胞和亞細胞角度研究作為基本功能單位的膈肌細胞的變化，對揭示膈肌的作用及其機制具有重要意義。流式細胞術可以對組織細胞及亞細胞結構進行分析，制備高質量的單細胞懸液是流式細胞術研究的前提。組織分離、酶解和機械解離是使細胞外基質降解和單細胞分離的三個重要步驟，常用的方法是機械法和機械—酶消化法。機械法適用于一些質地較嫩的組織，如肝臟、脾臟等，這些組織質地松軟，易于研磨和碾碎，通過機械法即可獲得較為滿意的效果。機械—酶消化法是將實體組織剪碎，再根據不同組織選用相應的消化酶，制成單細胞懸液。我們的前期研究顯示，采用機械—酶消化法制備的大鼠膈肌單細胞懸液優于單純的機械法或酶消化法［2-3］。2019 年 6 月—2020 年 6 月，本研究在此基礎上，探索機械—酶消化法制備大鼠膈肌單細胞懸液的最適宜的消化酶濃度，旨在為研究膈肌獲得更優質的單細胞懸液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年SD大鼠6只，購自成都達碩實驗動物有限公司，4～5 周齡，體質量80～130 g，雌雄兼用。本實驗通過大理大學倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白酶、膠原酶Ⅰ型、膠原酶Ⅳ型以及胎牛血清（FBS）、臺盼藍均購自Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于Hyclone 公司；流式抗體鼠抗CD11b PE（120030-83）和細胞染色緩沖液（Staining Buffe）購于eBoscience Inc；10%水合氯醛溶液由大理大學第一附屬醫院制劑室提供。

1.1.3 主要儀器 恒溫水浴鍋（上海圣科儀器設備有限公司）；臺式離心機（美國貝克曼庫爾特）；流式細胞儀（美國BD公司）；普通光學顯微鏡（廈門Motic公司）；細胞計數板（上海精密儀器公司）。

1.2 消化酶濃度的組合 將胰蛋白酶稀釋為0.125%、0.250%、0.375%、0.500%、0.625%，膠原酶Ⅰ型稀釋為0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%，膠原酶Ⅳ型稀釋為0.050%、0.100%、0.150%、0.200%、0.250%。將三種消化酶按照從低濃度到高濃度依次組合為五個濃度組，即：胰蛋白酶0.125%+膠原酶Ⅰ0.050%+膠原酶Ⅳ0.050%、胰蛋白酶0.250%+膠原酶Ⅰ0.100%+膠原酶Ⅳ0.100%、胰蛋白酶0.375%+膠原酶Ⅰ0.150%+膠原酶Ⅳ0.150%、胰蛋白酶0.500%+膠原酶Ⅰ0.200%+膠原酶Ⅳ0.200%、胰蛋白酶0.625%+膠原酶Ⅰ0.250%+膠原酶Ⅳ0.250%。三種消化酶各0.27 mL，組合成0.81 mL的混合液。

1.3 大鼠膈肌單細胞懸液的制備 采用機械—酶消化法。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，切開胸部和腹部，暴露并迅速完整取出膈肌，放入預冷的平皿中，PBS液反復沖洗。用眼科剪將所得大鼠膈肌剪為糊狀，分成12份，A、B、C、D、E組及對照組各2份。A～E組各取0.1 g膈肌組織，裝入含有不同濃度組合消化酶的EP 管，對照組加入等量PBS 溶液。37 ℃恒溫水浴鍋消化30 min，期間每隔5 min 吹打1 次。用200目濾網濾至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入等量PBS震蕩，漂洗2次，再離心、棄上清。加入等體積2%FBS 終止消化。每組最終獲得0.5 mL單細胞懸液，放入4 ℃冰箱保存待檢。

1.4 單細胞懸液中細胞計數方法 取膈肌單細胞懸液，按1∶1 的比例加入臺盼藍混勻，靜置2 min。滴入細胞計數板，顯微鏡下觀察細胞形態、雜質，計數每個小方格的活細胞、死細胞和細胞團塊數目，以活細胞數/（活細胞數+死細胞數）×100%計算細胞存活率。

1.5 單細胞懸液質量評價 采用流式細胞術。選用流式抗體Anti-Rat CD11b PE 熒光染色標記樣品中的中性粒細胞。將單細胞懸液加入5 mL 的BD 流式管，FBS 漂洗，1 200 r/min 離心 5 min，重復 1 次。加入2μL 鼠抗CD11b PE 抗體原液，震蕩混勻，常溫下避光孵育30 min。加入1 mL 含3%FBS 的細胞染色緩沖液，1 200 r/min離心5 min，洗去多余的抗體。加入400 μL 含3% FBS 的細胞染色緩沖液重懸，置4 ℃冰箱待檢。應用Cell Quest 軟件自動獲取每組3×105個細胞，ModFit LT 軟件進行圖像分析。分析前側相散點圖，設門圈定后，計算熒光標記的CD11b陽性細胞數占活細胞總數的百分比，獲得中性粒細胞在活細胞中的標記率。當細胞總量恒定，熒光標記的CD11b 陽性細胞數所占的比值越高，代表單細胞懸液的質量越好。

1.6 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料以表示，經方差齊性檢驗顯著性均大于0.05，故采用兩樣本均數比較的t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組單細胞懸液中細胞計數結果比較 見表1。A～E 組獲得活細胞數量最多的是B 組，最少是E 組；死細胞數最少的是C 組，最多是B 組；細胞團塊 C 組最少，E 組最多；存活率 C 組最高，E 組最低；單細胞懸液濃度B 組最高，E 組最低；A～E組獲得的活細胞數均高于對照組，其中B 組和C組活細胞數量和單細胞懸液濃度高于其他各組（P均＜0.05）。

表1 各組細胞計數結果比較（）

表1 各組細胞計數結果比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與B、C組比較，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組E組對照組單細胞懸液濃度（×105/mL）19.50±0.70*△30.25±3.89*22.75±2.47*20.00±0.71*△17.50±1.41*△6.50±0.71活細胞（×105/mL）156.00±11.36*△200.92±20.64*182.08±15.76*160.00±17.04*△140.02±13.84*△52.03±14.24死細胞（×105/mL）24.12±12.16*△28.00±10.48*16.20± 8.48*20.16 ± 8.92*△22.08±11.84*△60.05±15.68存活率（%）87.01 ± 5.32*△90.02± 7.38*91.86± 5.52*90.75 ± 9.19*△86.94 ± 7.17*△49.40±19.02團塊（個/mL）19.20 ± 7.36*△22.08±14.72*10.08±11.84*16.00±12.16*△26.08±11.04*△48.00±12.20

2.2 各組單細胞懸液質量比較 見表2。C 組D11b 陽性的中性粒細胞數、CD11b 陽性細胞占活細胞的百分比均高于其他各組（P均＜0.05）。

表2 各組被抗體CD11b標記細胞結果比較（）

表2 各組被抗體CD11b標記細胞結果比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05。

組別A組B組C組D組E組對照組CD11b陽性細胞占活細胞百分比（%）11.48±2.52*△14.98±2.16*△29.95±3.47*19.02±2.85*△15.85±0.38*△2.03±0.86 D11b陽性細胞（×103/mL）2.54±1.34*△3.67±1.43*△5.72±2.52*4.18±1.74*△3.38±0.94*△0.54±0.17

3 討論

膈肌功能與許多疾病的發生和發展相關聯，并且隨著不同的疾病而改變，但具體的機制尚未完全闡明［4-6］。細胞作為器官功能的基本結構單位，從細胞及亞細胞結構層面進行研究對揭示呼吸系統疾病發生時膈肌功能變化或膈肌的變化與呼吸系統疾病的關系將是關鍵的步驟，制備優質的膈肌大鼠單細胞懸液是前提［7-9］。根據需要研究的組織，單細胞懸液的制備方法各有不同，但多采用機械法或酶消化法，也有利用機械法結合酶法進行消化的。膈肌屬于骨骼肌，用單純機械法或單純用酶法制備膈肌單細胞懸液均難以獲得理想的結果，課題組前期利用機械法結合酶法成功制備了膈肌組織單細胞懸液，而且通過探索發現，機械法結合酶法進行消化比用單純的機械法或酶法獲得單細胞懸液的質量較高，但如何獲得優質的膈肌單細胞懸液仍需要進一步探索。研究顯示，不同酶濃度消化組織獲得的單細胞懸液質量是不一樣的［10-14］，低濃度不利于組織的充分消化，而酶濃度過高將會破壞細胞表面的抗原，均無法獲得優質的單細胞懸液［15-16］。

作為骨骼肌的膈肌，通過機械剪碎和酶的消化，難以獲得大量完整的肌細胞單細胞懸液，但已知膈肌是對缺氧最為敏感的器官，缺氧與炎癥反應相關聯和炎癥能導致器官結構與功能的變化，中性粒細胞浸潤程度體現炎癥反應的程度。當炎癥因子刺激時，中性粒細胞表面的CD11b 活化，在成熟的中性粒細胞表面可以大量表達CD11b［17-18］，通過標記CD11b 可以檢測膈肌中性粒細胞的數量，進而了解膈肌的狀態，也可以評價單細胞懸液的質量。因此，本研究在前期工作基礎上，結合機械法和酶法并利用不同酶濃度組合對膈肌組織進行消化，探索獲得高質量膈肌單細胞懸液的最適宜酶濃度。

本研究利用新鮮膈肌組織，采用機械剪碎并用不同濃度的多種酶組合進行消化制備單細胞懸液，在光鏡下計數懸液中的活細胞數、死細胞數、細胞存活率、細胞團塊和單細胞懸液的濃度，當酶濃度組合為胰蛋白酶0.375%、膠原酶Ⅰ0.150%、膠原酶Ⅳ0.150%和胰蛋白酶0.250%、膠原酶Ⅰ0.100%、膠原酶Ⅳ0.100%時，能獲得較高質量的單細胞懸液，懸液中有較多的活細胞數和較高的懸液濃度與細胞存活率，而且懸液中死細胞數和細胞團塊均較少。在對以上兩種酶濃度組合消化獲得的單細胞懸液的進一步研究中，經流式抗體CD11b 標記后用流式細胞術進行檢測，以酶濃度組合為胰蛋白酶0.375%、膠原酶Ⅰ0.150%和膠原酶Ⅳ0.150%時被標記的陽性細胞數量最多，細胞標記率最高。因此認為，酶濃度組合為胰蛋白酶0.375%、膠原酶Ⅰ0.150%和膠原酶Ⅳ0.150%是制備膈肌單細胞懸液最適宜的酶濃度。