桂枝去桂加茯苓白術湯含藥血清對TGF-β1誘導的人腎小管上皮細胞EMT的抑制作用及其機制

孫妍，李清初 ，，谷翠芝，葛汝村 ，孟凡華，畢慧欣

1 山東省立第三醫院腎內科，濟南 250031；2 桂林醫學院附屬醫院腎內科

急性腎損傷（AKI）是臨床較為常見的一種急危重癥。AKI 大多發展為慢性腎臟病，甚至進展至終末期腎病，但目前尚無特異性治療措施，尋求新的治療靶點是當前亟需解決的問題。腎間質纖維化是急性腎損傷發展為慢性腎臟病的關鍵環節，而腎小管上皮—間充質轉化（EMT）是腎間質纖維化發生的關鍵機制［1-2］。EMT 是指在特定條件下上皮細胞轉化為間充質細胞的生物學過程。與EMT 發生相關的通路有很多，其中轉化生長因子β1（TGF-β1）/細胞因子Smad 信號轉導途徑是最為強烈的致腎小管細胞EMT 的信號通路［3］。除 Smad 通路外，TGF-β1還可通過各種非Smad依賴途徑誘導EMT，包括絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑［4］。中醫藥在防治小管間質損害、延緩慢性腎功能衰竭方面具有一定的臨床療效。桂枝去桂加茯苓白術湯是辛溫解肌、健脾利水的代表方，主治太陽中風證或脾虛水氣證。臨床研究顯示，桂枝去桂加茯苓白術湯治療AKI 可顯著改善患者的腎功能［5-6］。但其作用機制是否與腎小管上皮細胞EMT 和腎間質纖維化有關目前尚不清楚。2019 年 12 月—2020 年 10 月，我們使用 TGF-β1誘導人腎小管上皮細胞EMT，觀察桂枝去桂加茯苓白術湯對 TGF-β1/Smad3 及 TGF-β1/MAPK 信號通路活性的影響，并探討其作用機制，為該方劑防治腎纖維化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 SPF 級8 周齡雄性SD 大鼠40只，購自濟南朋悅實驗動物技術有限公司。飼養于山東省立第三醫院動物實驗室。動物在光暗周期為12 h/12 h環境中適應性喂養5 d，自由進食進水。人腎小管上皮細胞HK-2 購自武漢普諾賽生命科技有限公司（美國ATCC細胞庫）。

1.1.2 藥物與試劑 桂枝去桂加茯苓白術湯的方藥組成為芍藥15 g、甘草10 g、生姜15 g、白術15 g、茯苓15 g、大棗20 g，藥物購自山東省立第三醫院。稱取中藥，加水500 mL，浸泡30 min 后煎煮45 min，過濾去渣，把過濾后的藥汁在100 ℃恒溫干燥箱中蒸發濃縮至100 mL，含生藥0.9 g/mL，裝瓶密封，置4 ℃冰箱保存備用。MEM 細胞培養基、胎牛血清、雙抗及胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司；MTT 試劑盒購自北京索萊寶公司；GAPDH、E鈣黏蛋白（E-cadherin）、α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vimintin）、Smad3、細胞外調節蛋白激酶（ERK）、p38、JNK 單克隆抗體以及磷酸化抗體p-Smad3、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK 抗體均購自英國Abcam 公司。

1.1.3 主要儀器 CO2細胞培養箱（美國Thermo 公司），熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司），穩壓穩流電泳儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 大鼠含藥血清制備 將大鼠分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和空白對照組各10只，根據“人和動物間體表面積折算的等效劑量比率表”進行換算，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予桂枝去桂加茯苓白術湯5、10、20 g/（kg·d）灌胃，正常對照組給予等體積生理鹽水灌胃。每日1 次，連續7 d。末次灌胃 1 h 后腹主動脈采血，4 ℃、3 000 r/min 離心20 min，取上清。56 ℃水浴箱滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，-80 ℃冰箱保存。

1.3 細胞培養 將HK-2 細胞加入含10% FBS 的MEM 培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞貼壁生長至80%左右時進行分組并干預。

1.4 細胞分組與干預 取HK-2 細胞，以1×105/孔接種于6孔板中。將細胞分為5組，空白對照組加入空白對照組大鼠血清；TGF-β1組加入5 ng/mL TGF-β1；低濃度含藥血清干預組加入低劑量組大鼠含藥血清后，再加入5 ng/mL TGF-β1；中濃度含藥血清干預組加入中劑量組大鼠含藥血清后，再加入5 ng/mL TGF-β1；高濃度含藥血清干預組加入高劑量組大鼠含藥血清后，再加入5 ng/mL TGF-β1。各組均培養48 h。

1.5 細胞中EMT 標志蛋白、MAPK 信號通路蛋白、Smad3 信號通路蛋白表達檢測 采用Western blotting 法檢測細胞中EMT 標志蛋白E-cadherin、α-SMA、Vimintin 蛋白表達，MAPK 信號通路相關蛋白 ERK1/2、p38、JNK 磷酸化水平，Smad3 信號通路蛋白Smad3 磷酸化水平。收集各組細胞，提取細胞總蛋白，于98 ℃金屬浴加熱10 min 進行蛋白變性，使用BCA 蛋白測定試劑盒進行蛋白定量。經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、5%BSA-TBST 封 閉 后 ，分 別 加 入 1∶5 000 稀 釋 的GAPDH 及 1∶1 000 稀釋的一抗，4 ℃搖床過夜。辣根過氧化物酶標志的二抗檢測雜交蛋白，ECL超敏發光液進行化學發光掃描成像。以GAPDH為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達 量 ，以 p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-Smad3 與ERK1/2、p38、JNK、Smad3 的比值代表 ERK1/2、p38、JNK、Smad3 蛋白磷酸化水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞EMT 標志蛋白表達水平比較 見表1。

表1 各組細胞EMT標志蛋白表達水平比較（）

表1 各組細胞EMT標志蛋白表達水平比較（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

Vimintin 1.00±0.03 1.13±0.04*0.96±0.09#0.82±0.15#0.78±0.09##組別空白對照組TGF-β1組低濃度含藥血清干預組中濃度含藥血清干預組高濃度含藥血清干預組E-cadherin 1.00±0.10 0.35±0.09**0.50±0.02 0.59±0.05#1.14±0.05##α-SMA 1.00±0.14 4.73±0.22**4.41±0.17 2.83±0.40##2.59±0.21##

2.2 各組細胞MAPK、Smad3 通路蛋白磷酸化水平比較 見表2。

表2 各組細胞MAPK、Smad3通路蛋白磷酸化水平比較（）

表2 各組細胞MAPK、Smad3通路蛋白磷酸化水平比較（）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白對照組TGF-β1組低濃度含藥血清干預組中濃度含藥血清干預組高濃度含藥血清干預組Smad3 1.00±0.08 2.17±0.19**2.26±0.26 1.66±0.12#1.33±0.14##ERK1/2 1.00±0.07 2.14±0.42*1.39±0.14 1.41±0.19 1.18±0.07#JNK 1.00±0.06 1.78±0.33*1.08±0.23 0.95±0.07#0.64±0.05##p38 1.00±0.08 1.50±0.19*0.99±0.11#0.84±0.10#0.75±0.06##

3 討論

AKI 是臨床常見的急危重癥，除具有較高的死亡風險外，其遠期預后也不容樂觀，常進展為慢性腎臟病甚至終末期腎臟疾病［5］。與未發生AKI 的人群相比，AKI 患者發生CKD 的風險升高約 8 倍，發生ESRD 的風險升高約 3 倍［6］。動物實驗顯示，腎小管EMT 是AKI 進展至CKD 腎臟間質纖維化的重要發病機制之一［7-8］。AKI 發生后，當損傷較重或損傷持續存在時，腎小管上皮細胞不能完成正常的增殖分化進行自我修復，而是發生過度活化而轉分化為肌成纖維細胞，持續分泌炎癥因子和促纖維化因子，引起慢性腎小管—間質炎癥反應和纖維化，促使AKI向 CKD 轉化［9］。抑制 EMT 進程對延緩或阻止 AKI向CKD 轉化具有重要意義。桂枝去桂加茯苓白術湯是中醫經典方劑，證見于《傷寒論》“服桂枝湯，或下之，仍頭項強痛，翕翕發熱，無汗，心下滿，微痛，小便不利者，桂枝去桂加茯苓白術湯主之”。我們的前期研究表明，桂枝去桂加茯苓白術湯用于治療AKI療效滿意，1 周內患者尿素氮、肌酐、中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白、腎損傷因子1明顯降低，腎功能快速恢復［10-11］。在膿毒血癥性AKI 大鼠中，桂枝去桂加茯苓白術湯可抑制NF-κB、TNF-α 信號通路，通過抑制炎性因子分泌，抑制膿毒癥對腎組織的損傷，從而抑制 AKI 發展至 CKD［12］。但在 AKI 進展至CKD 過程中，桂枝去桂加茯苓白術湯能否抑制EMT進而延緩CKD的進展尚未可知。

EMT 是指細胞黏附分子（如E-cadherin）和上皮分化標志物（如細胞角蛋白）的丟失，以及間質標志物（如N-cadherin、Vimentin 和α-SMA）的上調。本研究利用 TGF-β1誘導 HK-2 細胞建立 EMT 模型，在腎小管上皮細胞EMT 發生過程中，上皮細胞標志蛋白E-cadherin 表達顯著減低、間質細胞標志蛋白α-SMA、Vimintin 表達升高，提示腎小管上皮細胞EMT 造模成功。經過不同劑量桂枝去桂加茯苓白術湯含藥血清干預后，細胞中E-cadherin 蛋白表達明顯升高，α-SMA、Vimintin 表達明顯降低，這種效應在高濃度組中更顯著，提示桂枝去桂加茯苓白術湯能夠抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞EMT 的發生。

EMT 過程中，由TGF-β1誘導間質基質產生肌成纖維細胞中發揮顯著作用。TGF-β1信號通過多種Smad 和非 Smad 信號途徑傳遞，其中 Smad3 是 Smad依賴信號通路中最為關鍵的下游因子，而MAPK 信號通路則是TGF-β1誘導腎小管上皮細胞EMT 的重要非 Smad 依賴信號通路之一［13］。TGF-β1/Smad3 信號通路在AKI 轉歸中起重要作用，表現為Smad3 的過度活化，基因敲除Smad3 可以顯著抑制缺血所致腎功能丟失，減輕腎小管壞死以及炎性反應因子的分泌［14］。在不同病因所引起的腎纖維化模型中，敲除Smad3基因可以明顯緩解腎纖維化程度和Ⅰ型膠原蛋白的表達［15］。因此，持續活化TGF-β1/Smad3信號通路不僅加劇AKI 的病情，還促進AKI 向CKD 的轉化。本研究結果顯示，不同濃度桂枝去桂加茯苓白術湯含藥血清能明顯降低TGF-β1誘導的HK-2 細胞內Smad3 蛋白磷酸化水平，且高濃度組效果更為明顯。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑即ERK1/2、JNK 和 p38 MAPK 調控 EMT［16］。研究證實，對 ERK或p38 MAPK 通路的抑制能顯著削弱細胞的表型轉化［4］。在大鼠單側輸尿管梗阻模型及TGF-β1刺激下的腎小管上皮細胞中通過抑制JNK MAPK 通路可以實現對腎小管EMT 及腎纖維化的部分逆轉［16］。本研究結果顯示，給予 TGF-β1誘導 HK-2 細胞 48 h 后，ERK1/2、JNK 和 p38 蛋白磷酸化水平顯著上調；給予不同濃度桂枝去桂加茯苓白術湯含藥血清干預HK-2 細胞后，ERK1/2、JNK 和 p38 蛋白磷酸化水平均下調，且對JNK 和p38 蛋白磷酸化水平下調更顯著。

綜上所述，桂枝去桂加茯苓白術湯能顯著抑制TGF-β1誘導的 HK-2 細胞 EMT 過程，其作用機制可能與其抑制 TGF-β1/Smad3、TGF-β1/MAPK 信號通路的激活有關。