牛乳鐵蛋白對大鼠腦出血的治療作用及其與鐵代謝和脂質過氧化的關系

彭思源，扶猛，鄭曉梅

西南醫科大學附屬醫院神經內科，四川瀘州 646000

腦出血具有高病死率及高致殘率。腦出血發生后，血液成分經降解生成游離鐵等毒性物質，誘導發生細胞損傷、鐵死亡等［1］。鐵代謝在機體內環境穩態中極其重要，組織中鐵超載與神經系統退行性疾病、腦部腫瘤等疾病密切相關［2］。IRE/IRP 系統是機體鐵代謝的重要調控機制，在IRE/IRP 調節系統中，鐵調節蛋白2（IRP2）與位于靶基因轉錄本的非翻譯區內的鐵結合元件（IRE）結合，在轉錄后主要編碼鐵代謝蛋白如鐵蛋白、轉鐵蛋白受體（TFR）及二價鐵金屬轉運體（DMT1）等［3］。鐵死亡是一種在鐵離子催化下發生的，以細胞內活性氧（ROS）堆積、使細胞內氧化還原失衡為特征的細胞死亡形式［4］。鐵離子可結合轉鐵蛋白—轉鐵蛋白受體（TF-TFR）復合物，并在DMT1 的介導下，經內吞作用轉移至胞內［5］。過量鐵離子在細胞中催化產生大量自由基（主要是ROS），誘導脂質過氧化反應，破壞細胞脂質膜［6］。鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2 均為 IRE/IRP 調節系統中的關鍵蛋白，其中又以DMT1、IRP2為重點觀察指標。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是一種細胞內抗氧化酶，是脂質過氧化反應中的重要指標［7］。有研究顯示，抗氧化劑去鐵胺（DFX）可以通過血腦屏障（BBB）與鐵離子螯合，形成穩定的絡合物，減少自由基產生及脂質過氧化［8］。乳鐵蛋白（LF）是一種多功能鐵結合糖蛋白，在抗炎、ROS 調節、免疫過程中起重要作用［9］。中性粒細胞分泌的LF 會在腦出血后增加，它能結合游離鐵而減輕鐵超載，對鐵代謝起到調節作用［10］。2021 年 7 月—2022 年 2 月，我們對腦出血大鼠給予牛乳鐵蛋白（bLF）進行干預，觀察大鼠鐵代謝、脂質過氧化情況，探討bLF對腦出血后腦組織的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年健康雄性SD 大鼠105 只，體質量200～300 g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物許可證SCXK（鄂）2020-0018。飼養條件：12 h光照/12 h 黑暗循環，室溫24 ℃左右，相對濕度50%左右，保持通風、清潔。實驗期間大鼠自由飲食、飲水、活動。本實驗方案通過西南醫科大學實驗動物倫理審查。

1.1.2 主要試劑與儀器 鐵蛋白抗體購自CST 公司；BLF購自麥克林公司；BCA 蛋白質濃度測定試劑盒、ECL 發光檢測試劑盒購自ASPEN 公司；GAPDH抗體、TFR 抗體、IRP2 抗體購自 Abcam 公司；DMT1抗體、GPX4 抗體購自武漢三鷹公司。組織鐵測定試劑盒購自南京建成公司，活性氧檢測試劑盒購自百奧萊博公司。大鼠立體定位儀購自深圳市瑞沃德公司；酶標儀購自Diatek公司。

1.2 動物分組與造模 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、bLF 組，每組 30 只。其余 15 只大鼠用于實驗過程死亡大鼠的補充。大鼠麻醉，固定于大鼠立體定位儀，進行右側基底節區定位，備皮，剝離頭皮組織。用電鉆鉆直徑1 mm 的圓孔，深度達硬腦膜表面。模型組和bLF 組使用微量取樣器取大鼠尾靜脈血50μL，沿鉆孔進針6.0 mm，以10μL/min緩慢注射20 μL 血液，靜置5 min 后再以同樣速度注射剩余的30 μL 血液，靜置10 min 后緩慢退針，常規消毒縫合。假手術組按上述方法注射50 μL生理鹽水。

1.3 干預處理 造模成功后，bLF 組給予bLF 85 mg/kg 灌胃，模型組和假手術組給予等量生理鹽水灌胃，1次/天。

1.4 神經功能缺損情況評價 造模后1、3、7 d，三組分別隨機取3 只大鼠，根據改良神經功能缺損評分量表（mNSS）進行評分，分數越高表示損傷越重，總分18分。

1.5 標本取材 各組于造模后1、3、7 d 分別取10只大鼠，常規麻醉后開胸暴露心臟，進行心臟灌流。離斷頸髓后，取出腦組織，穿刺取血腫周圍組織。其中3 只大鼠的血腫周圍腦組織置于4%多聚甲醛溶液固定，經脫水、二甲苯透明、浸蠟、切片后，用于觀察病理改變；7 只大鼠的血腫周圍腦組織用于檢測鐵離子、ROS 含量檢測及鐵蛋白、DMT1、TFR、IRP2、GPX4蛋白表達。

1.6 血腫周圍腦組織細胞形態觀察 采用HE 染色法。取血腫周圍腦組織石蠟切片，經二甲苯及乙醇脫蠟、復水，蘇木素染液浸泡染色。再經分化、返藍、伊紅染液染色，最后脫水、二甲苯透明、樹脂封片，顯微鏡下觀察血腫周圍組織細胞形態。

1.7 血腫周圍腦組織中鐵離子、ROS含量檢測 取血腫周圍腦組織，生理鹽水漂洗后制成勻漿，4 000 r/min 離心5 min，取上清液。使用比色法測定鐵離子含量，化學熒光法測定ROS 含量，按照試劑盒說明書操作。

1.8 血腫周圍腦組織中鐵蛋白、DMT1、TFR、IRP2、GPX4 蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取血腫周圍腦組織，經常規蛋白提取、測定蛋白質含量、調整蛋白質濃度后，進行上樣、SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉，加入稀釋后的鐵蛋白（1∶1 000）、TFR（1∶1 000）、DMT1（1∶1 000）、IRP2（1∶500）、GPX4（1∶2 000）一 抗 4 ℃ 過 夜 。TBST 洗滌，加入HRP 標記的二抗（1∶10 000），室溫孵育30 min。滴加ECL 試劑，于暗室中曝光、顯影。使用AlphaEaseFC 軟件分析，以GAPDH 作為內參，以目的條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法 采用SPSS26.0 軟件。對計量資料進行正態分布及方差齊性檢驗，符合正態分布的數據以表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD 檢驗，重復測量數據行重復測量方差分析。使用Pearson 法進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組造模后不同時間點mNSS 評分比較 與假手術組比較，模型組各時間點評分均升高，其中造模后3 d 評分高于造模后1 d 和7 d；與模型組比較，bLF組各時間點評分均下降（P均＜0.05）。見表1。

表1 三組造模后不同時間點mNSS評分比較（分，）

表1 三組造模后不同時間點mNSS評分比較（分，）

注：與假手術組相同時間點比較，*P＜0.05；與模型組相同時間點比較，#P＜0.05；與同組造模后3 d比較，△P＜0.05。

造模后7 d 0.67±0.58 8.33±0.58*△6.00±1.00*#△組別假手術組模型組bLF組n 3 3 3造模后1 d 0.67±0.58 10.33±0.58*△7.33±1.53*#△造模后3 d 0.33±0.58 12.00±1.00*10.00±1.00*#

2.2 三組造模后血腫周圍細胞形態比較 假手術組無明顯出血及炎細胞浸潤，腦細胞、組織結構完整排列整齊。與假手術組比較，模型組大量紅細胞分布于破損腦組織周圍，血腫周圍炎癥細胞浸潤，細胞排列紊亂，組織結構不完整。bLF 組各時間點的炎癥細胞浸潤、細胞結構紊亂情況介于假手術組與模型組之間。

2.3 三組造模后不同時間點腦血腫周圍組織中鐵離子、ROS含量比較 與假手術組比較，模型組相同時間點鐵離子、ROS 含量增多；與模型組比較，bLF組相同時間點鐵離子、ROS 含量減少（P均＜0.05）。模型組、bLF 組內 3 d 與 7 d 時的鐵離子和 ROS 含量比較差異無統計學意義。見表2。

表2 三組造模后不同時間點腦血腫周圍組織中鐵離子、ROS含量比較（）

表2 三組造模后不同時間點腦血腫周圍組織中鐵離子、ROS含量比較（）

注：與假手術組相同時間點比較，*P＜0.05；與模型組相同時間點比較，#P＜0.05；與同組造模后3 d、造模后7 d相比較，▲P＜0.05。

鐵離子（μg/g）ROS（AU/mg）組別假手術組造模后1 d造模后3 d造模后7 d模型組造模后1 d造模后3 d造模后7 d bLF組造模后1 d造模后3 d造模后7 d n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 0.05±0.01 0.05±0.01 0.04±0.01 15.33±0.58 15.33±1.15 15.33±0.58 0.15±0.02*▲0.48±0.04*0.48±0.03*24.00±1.00*▲50.00±2.00*52.67±1.53*21.00±2.00*#▲30.67±1.53*#32.67±2.52*#0.12±0.01*#▲0.37±0.05*#0.37±0.03*#

2.4 三組造模后不同時間點腦血腫周圍組織中鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2、GPX4 蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2表達升高，GPX4表達降低（P均＜0.05）；與模型組比較，bLF 組鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2 表達降低，GPX4 表達升高（P均＜0.05）。模型組及bLF 組鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2 在第3 天時達到最高點，GPX4在第3天時達到最低點。見表3。

表3 三組造模后不同時間點腦血腫周圍組織中鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2、GPX4蛋白表達水平比較（）

表3 三組造模后不同時間點腦血腫周圍組織中鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2、GPX4蛋白表達水平比較（）

注：與假手術組相同時間點比較，*P＜0.05；與模型組相同時間點比較，#P＜0.05；與同組造模后1 d、造模后7 d比較，△P＜0.05。

組別假手術組造模后1 d造模后3 d造模后7 d模型組造模后1 d造模后3 d造模后7 d bLF組造模后1 d造模后3 d造模后7 d鐵蛋白TFR n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 DMT1IRP2GPX4 0.04±0.01 0.03±0.02 0.04±0.01 0.06±0.02 0.07±0.01 0.06±0.01 0.05±0.01 0.06±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 0.05±0.01 0.74±0.08 0.77±0.06 0.75±0.06 0.22±0.02*0.50±0.03*△0.39±0.07*0.50±0.08*0.95±0.06*△0.72±0.03*0.24±0.05*0.63±0.08*△0.45±0.08*0.29±0.07*0.77±0.05*△0.54±0.07*0.28±0.06*0.12±0.03*△0.46±0.07*0.55±0.01*#0.25±0.03*#△0.62±0.04*#0.10±0.03*#0.34±0.02*#△0.24±0.03*#0.34±0.03*#0.53±0.04*#△0.40±0.02*#0.13±0.02*#0.38±0.08*#△0.26±0.06*#0.16±0.06*#0.38±0.06*#△0.26±0.01*#

2.5 GPX4 與鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2 的相關性 bLF組GPX4與鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2表達均呈負相關（r分別為-0.687、-0.842、-0.668、-0.743，P均＜0.05）。

3 討論

LF 對鐵離子有很強的親和力，可有效減輕游離鐵參與的自由基形成和氧化損傷［11］。LF 主要由上皮細胞合成，也存在于中性粒細胞中，但小鼠實驗中證實即使大腦中的中性粒細胞數量達到峰值，LF 在大腦中總含量都非常低［12-13］。通過體外培養，bLF作用于特定的膜受體，這些受體蛋白可將bLF 內化在腦組織細胞內，以進行調節作用［14］。在豬仔作為人類新生兒動物模型的實驗中也證明了bLF在新生兒神經保護和認知中起重要作用［15］。

本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組造模后第 1、3、7 天的 mNSS 評分均升高，且第 3 天高于第1 天和第7 天；組織病理檢查顯示，模型組血腫周圍組織炎癥細胞浸潤，細胞排列紊亂。與模型組相比，bLF 組造模后第 1、3、7 天的 mNSS 評分均下降，組織病理檢查顯示血腫周圍組織損害減輕。這表明bLF能夠減輕腦組織病理損害，從而減輕腦出血造成的神經功能障礙。

鐵死亡是腦出血后一種重要的細胞死亡方式。腦出血后，血紅蛋白被吞噬細胞吞噬，產生大量鐵離子沉積，鐵離子與TF、TFR 形成復合物，經內吞進入細胞后再被釋放，過量鐵離子在細胞中催化產生大量自由基（主要是ROS），誘導脂質過氧化反應，破壞細胞脂質膜，造成細胞鐵死亡。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組鐵離子及ROS 含量增多，在第3 天后升至最高后下降，但鐵離子、ROS 分別在第3天與第7天含量基本持平，可能與此時鐵離子已達高峰但組織排鐵能力下降有關，而ROS 含量可能與組織鐵含量有關。與模型組相比，bLF 組鐵離子及ROS含量減少，同樣分別在第3天與第7天含量基本持平。表明腦出血后鐵離子發生聚集，引起ROS 增多；經bLF 干預后鐵離子、ROS 含量下降，表明bLF能有效減少腦出血后鐵離子蓄積和ROS 形成，從而減輕鐵離子過載產生造成的神經功能損傷。

TFR、DMT1、IRP2作為鐵代謝的關鍵分子，影響鐵沉積及鐵蛋白、ROS的形成。腦出血后，血腫周圍組織缺氧誘導多種鐵穩態相關蛋白質如鐵蛋白、TF和TFR 的表達，而DMT1作為鐵的主要轉運蛋白，能夠使細胞有效攝取鐵離子，并且DMT1 的表達可通過IRE/IRP 系統進行調節，有助于保持體內正常的鐵代謝［16-17］。IRP2通過與位于靶基因轉錄本非翻譯區內的IRE結合，調節鐵蛋白、TFR、DMT1、TF表達，參與鐵代謝。動物實驗表明，IRP2 基因敲除小鼠在腦出血后鐵蛋白表達下降，細胞過氧化程度降低［18］。IRE/IRP調節系統中IRP2與IRE的結合活性受到細胞內鐵離子濃度的調節，而其結合活性的變化又能調控鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2表達量。鐵超載后，IRP2 與 IRE 解離，IRP2 含量增多，同時 TFR、DMT1 表達也增多，鐵向細胞內轉運增多并以鐵蛋白的形式儲存［19］。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組TFR、IRP2、DMT1、鐵蛋白表達明顯上升，而在第3 天時升至最高后下降；與模型組相比，bLF組TFR、IRP2、DMT1、鐵蛋白表達均減少，均在第3天達到高峰，與模型組趨勢相似。表明腦出血后鐵代謝相關蛋白表達升高，但在第3天后開始下降，組織細胞可能在第3 天后已經開始恢復排鐵功能，開始組織細胞修復；經bLF干預后，鐵代謝蛋白含量下降，表明bLF 能夠抑制TFR、IRP2、DMT1、鐵蛋白表達，從而抑制鐵死亡、發揮神經保護作用。

腦出血后通過一系列反應產生ROS 在細胞中積累，觸發并加劇過氧化，導致細胞受損［20］。GPX4則是細胞內重要的抗氧化酶，它以GSH 為合成底物，是鐵死亡的關鍵調控因子［7，21］。脂質過氧化發生后，抗氧化劑GSH 大量消耗，使得GPX4 失活，從而引起脂質氧化代謝失衡。張紅霞等［22］報道，DMT1抑制劑依布硒林可以減少細胞內鐵含量，增加GSH含量和提高GPX4 活性，其機制可能是減少鐵向胞內的轉運繼而減輕鐵死亡。與假手術組相比，模型組中抗氧化劑GPX4明顯下降，在第3天時降至最低后上升；與模型組相比，bLF 組GPX4 含量增多，在3 d時降至最低后逐漸恢復，與模型組趨勢相似。腦出血后引起抗氧化劑GPX4 消耗，而bLF 干預后GPX4含量較模型組上升，表明bLF在脂質氧化中能減少抗氧化劑GPX4 失活；在腦出血早期抑制脂質過氧化病理損害，發揮神經保護作用。

我們進一步對bLF 組的鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2 表達進行相關性分析，結果顯示，抗氧化劑指標GPX4 與上述鐵代謝蛋白分別互為負相關。這表明bLF 可能是通過影響IRE/IRP 調節系統中鐵蛋白、TFR、DMT1、IRP2 下調，減少了組織細胞的脂質過氧化從而抑制鐵死亡，發揮神經保護作用。

綜上所述，腦出血大鼠經bLF 干預后神經功能明顯改善；bLF 可能抑制了鐵死亡的進一步發生，改善了脂質氧化，從而保護神經組織，這為腦出血的臨床治療提供了新的思路。